Transcript Slide 1

LACREMED
HUSRB/1002/214/147
Development of an enzymological (laccase-based)
remediation product and technology
Razvoj proizvoda i tehnologije za remedijaciju na
bazi primene enzima (lakaze)
Enzim- (lakkáz-) alapú bioremediációs termék és
technológia kifejlesztése
Microbiological methods developed within the LACREMED project
Guideline
This document has been produced with the financial assistance of the European Union. The content of the document is the sole responsibility of the Faculty of
Technology, University of Novi Sad, Serbia, and can under no circumstances be regarded as reflecting the position of the European Union and/or the Managing
Authority.
A LACREMED projekten belül kifejleszett mikrobiológiai módszerek
Útmutató
Ez a dokumentum az Európai Unió pénzügyi támogatásával valósult meg. A dokumentum tartalmáért teljes mértékben az Újvidéki Egyetem, Technológiai Kar,
Szerbia vállalja a felelősséget, és az semmilyen körülmények között nem tekinthető az Európai Unió és/vagy az Irányító Hatóság állásfoglalását tükröző
tartalomnak.
Microbiološke metode razvijene u okviru LACREMED projektu
Smernice
Ovaj dokument je odštampan uz finansijsku podršku Evropske unije. Za sadržaj ovog dokumenta je odgovoran isključivo Tehnološki fakultet, Univerzitet u Novom
Sadu, Srbija, i sadržaj ovog dokumenta ne odražava zvanično mišljenje Evropske unije i/ili Direktorata.
University of Novi Sad, Faculty of Technology Novi Sad, Serbia
Újvidéki Egyetem, Technológiai Kar
Univerzitet u Novom Sadu, Tehnološki fakultet Novi Sad, Srbija
Editor/Szerkesztő: Prof. Dr. Biljana Škrbić, e-mail: [email protected]
Edition: 30 copies, LACREMED©2013
LACREMED
Guideline on microbiological methods developed in
Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója
Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu
Harmful xenobiotics are abundant in the environment because of the intensive application of different pesticides in
the agriculture. Most of these compounds are harmful with proved or suspected toxic, carcinogenic, mutagenic,
teratogenic or endocrine disruptor effect. Some of them enter into the food chain when plants take up them from
contaminated water or agricultural soil.
Laccases are produced in many fungal species belonging to ascomycetes
and basidiomycetes groups, accordingly, the enzyme has already been
purified from various fungi. Laccases are typical for the woodrotting
basidiomycetes and a related group of litter-decomposing saprotrophic
fungi. Laccases utilize broad range of substrates, so they could oxidize
various xenobiotics and their degradation products. Moreover, they could
react with different redox mediators such as ABTS, methionine, phenol
and syringaldehyde. These are low molecular weight compounds which
could act as redox mediators after oxidization and could oxidize other
molecules expanding the spectrum of laccases (CAMARERO et al.,
2004). Up to now, more than 100 laccases have been purified and more
or less characterized from fungi. The molecular weight of a typical fungal
laccase is about 60-70 kDa, and they have around pH 4.0 isoelectric
point. Several laccase isoenzymes have been detected in many fungal
species (BALDRIAN, 2005), for example Pleurotus ostreatus has at least
10 of them (TÉLLEZ-TÉLLEZ et al., 2005). Like most fungal extracellular
enzymes, laccases are glycoproteins. The glycosylation ranges are
between 10% and 25%. (SHLEEV et al., 2004). Fungal laccases have pH
optimum in the lower pH range. In the case of ABTS substrate, the pH
optimum is generally lower than 4.0 (BALDRIAN, 2005).
Laccases (benzenediol: oxygen oxido-reductases, EC 1.10.3.2) are
polyphenol oxidases, containing four copper atoms, therefore they
are usually called multicopper oxidases. Laccases have received
much attention from researchers during the past decades, because
they have wide substrate range, and shown to be useful for the
removal of toxic compounds, like chlorinated aniline and phenol
xenobiotics (BOLLAG, 1992). Presence of these substances even at
very low concentrations in waters and agricultural soils creates
substantial danger: they and their degradation products could be
mutagenic, carcinogenic and teratogenic. In certain cases, the
degradation products may pose greater risks than the parent
compounds (WEI et al., 2011).
Guaiacol-containing plates used as
indicators of laccase production
Lakkáztermelés kimutatására
alkalmazott guajakol-tartalmú
táplemezek
Podloge sa gvajakolom korišćene kao
indikatori proizvodnje lakaza
A különböző peszticidek mezőgazdaságban történő alkalmazása miatt ártalmas xenobiotikumok vannak jelen a
környezetben. Ezeknek a vegyületeknek a többsége bizonyított vagy feltételezett toxikus, karcinogén, mutagén,
teratogén vagy endokrin diszruptor hatással rendelkezik. Némelyikük bejut a táplálkozási láncba is, mivel a
növények felveszik őket a szennyezett vizekből vagy mezőgazdasági talajokból.
A lakkázok (benzéndiol: oxigén oxido-reduktázok, EC 1.10.3.2)
polifenol-oxidázok, melyek négy rézatomot tartalmaznak, ezért
„multikopper-oxidázok”-nak is nevezik őket. A lakkázokra az
elmúlt évtizedekben a kutatók kiemelt figyelmet fordítottak, mivel
széles a szubsztrátkörük és alkalmasnak bizonyultak toxikus
vegyületek, pl. klórozott anilin- és fenol xenobiotikumok
eltávolítására. (BOLLAG és mtsai, 1992). Ezeknek a
vegyületeknek a jelenléte vizekben és mezőgazdasági talajokban
már nagyon kis koncentrációkban is komoly veszélyt jelent: a
vegyületek és bomlástermékeik ugyanis mutagén, karcinogén és
teratogén hatásúak lehetnek. Bizonyos esetekben a
bomlástermékek az alapvegyületeknél is nagyobb kockázatot
jelenthetnek (WEI és mtsai., 2011).
Lakkázok termelésére számos, a tömlősgombák és bazídiumos
gombák csoportjaiba tartozó gombafaj képes, ennek következtében
az enzimet különböző gombafajokból sikerült már kitisztítani. A
lakkázok a korhasztó bazídiumos gombák és az avarbontó szaprotróf
gombák egy csoportjának tipikus enzimei. A szubsztrátok széles
körét képesek felhasználni, így képesek különböző xenobiotikumokat
és bomlástermékeiket is oxidálni. Ezen túl különböző redoxmediátorokkal (pl. ABTS, metionin, fenol és sziringaldehid) is képesek
reagálni. Ezek a kis molekulasúlyú vegyületek oxidációjuk után redox
mediátorként képesek működni és más molekulákat oxidálnak,
kiterjesztve ezzel a lakkázok spektrumát (CAMARERO és mtsai.,
2005). Mostanáig közel 100 lakkázt tisztítottak és jellemeztek
gombákból. Egy tipikus gomba-lakkáz molekulasúlya 60-70 kDa,
izoelektromos pontja pedig pH 4.0 körüli. Sok gombafajban számos
lakkáz izoenzimet sikerült kimutatni (BALDRIAN, 2006), a Pleurotus
ostreatus például legalább 10 izoenzimmel rendelkezik (TÉLLEZTÉLLEZ és mtsai., 2005). A legtöbb, gombák által termelt
extracelluláris enzimhez hasonlóan a lakkázok is glikoproteinek. A
glikoziláció mértéke 10% és 25% közötti (SHLEEV és mtsai., 2004). A
gomba-lakkázok pH-optimuma az alacsonyabb pH-tartományba esik,
ABTS szubsztrát esetében általában alacsonyabb, mint 4.0
(BALDRIAN, 2006).
2
LACREMED
Guideline on microbiological methods developed in
Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója
Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu
Opasne materije se često nalaze u životnoj sredini delom i zbog široke primene različitih pesticida u poljoprivredi.
Mnogi pesticidi i njihovi degradacioni proizvodi imaju toksična, kancerogena, mutagena ili teratogena svojstva, a
takođe mogu negativno uticati i na rad endokrinih žlezda. Neki od njih ulaze u lanac ishrane usvajanjem od strane
biljaka koje žive u zagađenoj vodi ili na zagađenom poljoprivrednom zemljištu.
Lakaze (benzendiol:kiseonik oksido-reduktaze, EC 1.10.3.2) su
polifenolne oksidaze, koje sadrže četiri atoma bakra, pa se obično
nazivaju višebakarne oksidaze. Lakaze su privukle pažnju istarživača
poslednjih decenija, jer su pokazale mogućnost razgradnje širokog
spektra zagađujućih materija (kao što su hlorovani anilini i fenolni
ksenobiotici) te su i korisne za njihovo uklanjanje (BOLLAG,1992).
Prisustvo ovih ksenobiotika, čak i u malim koncentracijama u vodi i
poljoprivrednom zemljištu, predstavlja opasnost, jer mogu imati
kancerogena, mutagena i teratogena svojstva. U određenim
slučajevima, proizvodi razgradnje polaznih zagađujućih materija (npr.
pesticida) mogu da predstavljaju veći rizik po zdravlje ljudi i životnu
sredinu nego jedinjenja iz kojih su ti proizvodi nastali (WEI i
sar.,2011).
Lakaze predstavljaju proizvode metabolizma gljiva koje pripadaju
grupi askomiceta i bazidiomiceta, i do sada su dobijene u
prečišćenom obliku od raznih vrsta gljiva. Lakaze su tipične za
pošumljena područja gde se najčešće javlaju gljive prouzrokovači
truleži drveta i slične saprotrofne gljive.
Lakaze imaju sposobnost da oksiduju materije, uključujući i razne
ksenobiotike i njihove degradacione proizvode. Šta više, lakaze mogu da
reaguju sa različitim prenosiocima elektrona (redoks medijatorima) kao
što su ABTS, metionin, fenol i siringaldehid. Medijatori su jedinjenja male
molekulske mase koji imaju ulogu posrednika u prenosu elektrona nakon
oksidacije između enzima i supstrata i koji mogu da oksiduju druge
molekule i, na taj način, proširuju spektar jedinjenja na koje deluju lakaze
(CAMARERO et al., 2004). Do sada je izolovano više od 100 vrsta lakaza
iz raznih gljiva. Molekulska masa lakaza gljiva obično iznosi oko 60-70
kDa i njihova izoelektrična tačka je oko pH vrednosti 4,0. Nekoliko
izomera enzima lakaze je detektovano u mnogim vrstama gljiva
(TELLEZ-TELLEZ et al., 2005), kao što je u slučaju gljive Pleurotus
ostreatus iz koje je izolovano više od 10 izomernih enzima. Kao i većina
ekstracelularnih enzima i lakaze su glikoproteini. Opseg glikolizacije
enzima kreće od 10% do 25% (SHLEEV et al., 2004). Lakaze gljiva imaju
optimalnu aktivnost pri nižim pH vrednostima. U slučaju supstrata ABTS,
optimalna vrednost pH je obično niža od 4,0 (BALDRIAN, 2005).
3
LACREMED
Guideline on microbiological methods developed in
Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója
Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu
Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények
Isolation and identification of laccaseproducing fungi from environmental samples
For the isolation of laccase-producing white-rot fungi, one liter of basal
medium (BM) contains: 0.5 g KH2PO4, 0.2 g MgSO4.7H2O, 0.1 g
NH4NO3, 0.1 g KCl, 0.02 g FeSO4, 0.05 g Ca(NO3)2.4H2O, 2 g malt
extract and 15 g agar. After sterilization 0.4 ml guaiacol is to be added
for indicating the laccase activity. For the isolation of laccase
producers from air the isolation medium (LI) is the following for 1 liter:
10 ml glicerol, 1 g arginine, 1 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 1 g
MgSO4.7H2O, 0.002 g FeSO4, 0.002 ZnSO4 and 0.002 CuSO4.
The fungal DNA extractions can be carried out from fresh mycelia with
Aqua Genomic Solution Kit, according to the manufacturer’s
instructions. The identification of the isolates can be performed by
amplification and partial sequence analysis of the internal transcribed
spacer (ITS) region, using universal primers ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
and
ITS5
(5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) according to WHITE et al.
(1990). Sequence analyses can be carried using the NCBI BLAST
program (ALTSCHUL et al., 1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
Lakkáztermelő gombák izolálása és
azonosítása környezeti mintákból
A lakkáztermelő fehérkorhasztó gombák izolálására alkalmazott alaptáptalaj
literenként a következő összetevőket tartalmazta: 0,5 g KH2PO4, 0,2 g
MgSO4.7H2O, 0,1 g NH4NO3, 0,1 g KCl, 0,02 g FeSO4, 0,05 g
Ca(NO3)2.4H2O, 2 g malátakivonat és 15 g agar. Sterilizálás után a táptalajt
0,4 ml guajakollal kell kiegészíteni a lakkáz aktivitások kimutatása céljából.
A lakkáztermelők levegőből történő izolálására alkalmazható LI táptalaj a
következő összetevőket tartalmazza literenként: 10 ml glicerol, 1 g arginin,
1 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 1 g MgSO4.7H2O, 0,002 g FeSO4, 0,002 ZnSO4
és 0,002 CuSO4.
A gombaizolátumok DNS-ének kivonása friss micéliumból történik az Aqua
Genomic Solution Kit felhasználásával, a gyártó utasításai szerint. Az
izolátumok azonosítása a köztes átíródó elválasztó (ITS) régió
amplifikálásával és részleges szekvenciaelemzésével történhet az ITS4 (5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
és
ITS5
(5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)
univerzális
indítószekvenciák
felhasználásával WHITE és mtsai. (1990) szerint. A szekvenciaelemzések
az NCBI BLAST program (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, ALTSCHUL
és mtsai., 1990) felhasználásával kivitelezhetők.
Izolacija i karakterizacija gljiva iz životne
sredine sa sposobnošću stvaranja lakaza
Za izolaciju gljiva bele truleži sposobnih za stvaranje lakaza, jedan litar
osnovnog medijuma sadrži: 0,5 g KH2PO4, 0,2 g MgSO4.7H2O, 0,1 g
NH4NO3, 0,1 g KCl, 0,02 g FeSO4, 0,05 g Ca(NO3)2.4H2O, 2 g
ekstrakta slada i 15 g agara. Nakon sterilizacije, a u cilju utvrđivanja
aktivnosti lakaza neophodno je dodati 0,4 ml gvajakola. Za izolaciju
gliva iz vazduha sposobnih za stvaranje lakaza koristi se sledeća
podloga: 10 ml glicerola, 1 g arginina, 1 g KH2PO4, 1 g K2HPO4, 1 g
MgSO4.7H2O, 0,002 g FeSO4, 0,002 g ZnSO4 i 0,002 g CuSO4
(sadržaj je definisan za 1 litar poldloge).
Ekstrakcije DNK gljiva može se izvršiti iz svežih micelija pomoću
“Aqua Genomic Solution Kit” prema uputstvima proizvođača.
Indentifikacija izolata se može izvršiti analizama amplifikacije i
parcijalnim sekvenciranjem regiona (engl. “internal transcribed
spacer”),
koristeći
univerzalne
prajmere
ITS4
(5’TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)
i
ITS5
(5’GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) u skladu sa preporukama
WHITE i sar. (1990). Sekvence se mogu analizirati pomoću NCBI
BLAST
programa
(ALTSCHUL
et
al.,
1990,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).
4
LACREMED
Guideline on microbiological methods developed in
Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója
Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu
Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények
Investigation of laccase production
The production of laccases can be investigated in different liquid media. ME contains 20 g malt extract, 20 g glucose, 1 g peptone per liter. MEM liquid
media: one liter of ME base media supplemented with 80 μl of minerals (1.0 g CaCl2·2H2O, 1.0 g FeSO4·7H2O, 0.1 g ZnSO4·7H2O, 0.16 g
CuSO4·5H2O, and 1.0 g Na2EDTA per liter). MEMX media contains in addition to MEM, 1% xylan as indicator. Fifty milliliters of liquid media are to be
inoculated with agar pieces cut from well-grown mycelium. After 6 days of incubation at 28°C (180 rpm), the samples have to be centrifuged at
8000g for 10 minutes. The tenfold dilution of the cell free ferment broths serves as a basis for the activity assays.
Laccase activity can be determined by measuring the oxidation of ABTS [2,2-azinobis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulphonate)] spectrophotometrically
after 5 min incubation at 436 nm. The reaction mixture contains 5 mM ABTS in 25 mM succinate buffer (pH 4.5) (KIISKINEN ET AL., 2002 and 2004).
A lakkáztermelés vizsgálata
A lakkázok termelését különböző tápoldatokban lehet vizsgálni. Az ME tápoldat 20 g malátakivonatot, 20 g glükózt és 1 g peptont tartalmaz literenként.
A MEM tápoldat a ME alaptápoldat 1 literének 80 l ásványi oldattal (1,0 g CaCl2·2H2O, 1,0 g FeSO4·7H2O, 0,1 g ZnSO4·7H2O, 0,16 g CuSO4·5H2O és
1,0 g Na2EDTA literenként). történő kiegészítésével készíthető el. A MEMX tápoldat a MEM-hez képest még 1% xilánt tartalmaz indikátorként. A
tápoldatok 50 milliliterét jól növekedő micéliumból vágott agardarabokkal kell leoltani. Hat nap 28 °C-on, 180 rpm-mel történő rázatás után a mintákat
10 percig, 8000 g-vel centrifugáljuk. A aktivitásmérések alapjául a sejtmentes fermentlevek tízszeres hígítása szolgál.
A lakkáz aktivitásokat az ABTS [2,2-azinobisz-(3-etilbenzthiazolin-6-szulfonát)] oxidációjának mérése útján határozhatjuk meg 5 perc inkubáció után,
436 nm-en végzett spektrofotometriás méréssel. A reakcióelegy 5 mM ABTS-t tartalmaz 25 mM szukcinát pufferben (pH 4,5) (KIISKINEN ÉS MTSAI.,
2002 és 2004).
Ispitivanje stvaranja lakaza
Stvaranje lakaza može biti ispitivano u različitim tečnim podlogama ME, MEM, MEMX. Podloga ME sadrži 20 g ekstrakta slada, 20 g glukoze, 1 g
peptona (po litri podloge). MEM tečna podloga sadrži jedan litar osnovne podloge ME obogaćene sa 80 µl minerala (1,0 g CaCl2·2H2O, 1,0 g
FeSO4·7H2O, 0,1 g ZnSO4·7H2O, 0,16 g CuSO4·5H2O i 1.0 g Na2EDTA). Podloga MEMX sadrži 1% ksilan kao indikator u MEM podlozi. U 50 ml
podloge se unesu delovi agara podloge na kojoj su se dobro razvile micele. Nakon inkubacije u trajanju od 6 dana na 28°C (180 rpm), uzorci se
centrifugiraju (8000 g) 10 minuta. Kao osnova za ispitivanje aktivnosti koristi se desetostruko razblažena podloga iz koje su ukonjene ćelije.
Aktivnost lakaza se može odrediti spektrometrijski na 436 nm merenjem oksidacije ABTS [2,2-azinobis-(3-etilbenzdiazo-line-6-sulfonata)] nakon
inkubacije od 5 minuta. Reakciona smesa sadrži 5 mM ABTS u 25 mM sukcinatnom puferu (pH 4.5) (KIISKINEN ET AL., 2002 and 2004).
DP1 Ganoderma sp.
Sequence chromatogram of a fungal ITS region
Egy gomba ITS-régiójának szekvenciakromatogrammja
Sekvencijalni hromatogaram gljivičnog ITS regiona
Pleurotus ostreatus HK35
Enzyme activities of laccase producer fungi in different liquid media
Lakkáztermelő gombák enzimaktivitásai különböző tápoldatokban
Enzimske aktivnosti plesni-proizvođača lakaza u različitim tečnim
podlogama
5
LACREMED
Guideline on microbiological methods developed in
Kifejlesztett mikrobiológiai módszerek útmutatója
Smernice mikrobioloških metoda razvijenih u projektu
Experimental conditions/Eksperimentalni uslovi/Kísérleti körülmények
Investigation of the the degradation of different aniline and phenol derivatives by fungal
laccases
The following xenobiotics were investigated: 2,4-dichlorophenol; 2-methyl-4-chlorophenol; 3-chloroaniline; 4-chloroaniline; 2,6-dimethylaniline; 3,4dichloroaniline, 3-chloro-4-methylaniline. Reaction mixtures contained 1.5 ml of the ferment broth, which was mixed with equal volume of the distinct
pesticides (0.25 mM in 50 mM succinate buffer, pH 4.5). Final concentrations of the xenobiotics were 0.125 mM in 25 mM succinate buffer. If applied, the
concentration of the mediator (guaiacol) was 1 mM. The mixtures were incubated at 25 °C overnight. The reactions were terminated by removing the
laccase from the system with membrane filtration. The remaining concentrations of the xenobiotics were determined by methods described in the
LACREMED guidelines about the analytical methods for xenobiotics determination.
Különböző anilin- és fenolszármazékok gombaeredetű lakkázok általi lebontásának vizsgálata
Vizsgált xenobiotikumok: 2,4-diklórfenol; 2-metil-4-klórfenol; 3-klóranilin; 4-klóranilin; 2,6-dimetilanilin; 3,4-diklóranilin, 3-klór-4-metilanilin. A
reakcióelegyek 1,5 ml fermentlevet tartalmaztak, melyet a peszticidek azonos térfogatú oldataival (0,25 mM mennyiség 50 mM szukcinát pufferben, pH
4,5) kevertünk. A xenobiotikumok végkoncentrációja 0,125 mM volt 25 mM szukcinát pufferben. Amennyiben mediátor (guajakol) is felhasználásra
került, a koncentrációja 1 mM volt. Az elegyeket 25 °C-on, egy éjszakán át inkubáltuk. A reakciókat a lakkáz membránszűréssel történő eltávolításával
állítottuk le. A maradék xenobiotikumok koncentrációinak meghatározása a xenobiotikumok meghatározására szolgáló analitikai módszereket ismertető
LACREMED útmutatóban leírtak szerint történt.
Ispitivanje razgradnje različitih anilinskih i fenolnih derivata od strane lakaza izdvojenih iz gljiva
Degradation of xenobiotics by SZMC 21032,
without mediator
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
control, µg/ml
3-chloro4methylaniline
2,6dimethylaniline
4-chloroaniline
3-chloroaniline
2-methyl4chlorophenol
3,4dichloroaniline
mean concentration, µg/ml
Degradation of xenobiotics by SZMC 21032, with
mediator
35,00
30,00
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
control, µg/ml
3-chloro4methylaniline
2,6dimethylaniline
4-chloroaniline
2-methyl4chlorophenol
3-chloroaniline
3,4dichloroaniline
mean concentration, µg/ml
2,4dichlorophenol
3-chloro-4methylaniline
2,6dimethylaniline
4-chloroaniline
3-chloroaniline
mean concentration, µg/ml
concentration µg/ml
control, µg/ml
2-methyl-4chlorophenol
3-chloro-4methylaniline
2,6dimethylaniline
4-chloroaniline
3-chloroaniline
2-methyl-4chlorophenol
3,4dichloroaniline
2,4dichlorophenol
mean concentration, µg/ml
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
3,4dichloroaniline
control, µg/ml
Degradation of xenobiotics by SZMC 21031, with
mediator
2,4dichlorophenol
25,00
20,00
15,00
10,00
5,00
0,00
concentration µg/ml
Degradation of xenobiotics by SZMC 21031,
without mediator
2,4dichlorophenol
concentration µg/ml
concentration µg/ml
Ispitana je razgradnja sledećih ksenobiotika: 2,4-dihlorfenola; 2-metil-4-hlorfenola; 3-hloranilina; 4-hloroanilina; 2,6-dimetilanilina; 3,4-dihloranilina, 3-hlor4-metilanilina. Reakcione smese su sadržale 1,5 ml mikrobiološke podloge, pomešane sa jednakim zapreminama pojedinačnih jedinjenja od interesa
(0,25 mM odgovarajuće zagađujuće materije u 50 Mm sukcinatnom puferu, pH 4.5). Krajnja koncentracija ksenobiotika bila je 0,125 mM u 25 mM
sukcinatnom puferu. U slučaju ispitivanja uticaja medijatora dodat je gvajakol čija je krajnja koncentracija bila 1 mM. Smesa je inkubirana na 25 °C
tokom cele noći. Reakcije razgradnje su prekidane uklanjanjem lakaza iz sistema membranskom filtracijom. Preostale koncentracije ksenobiotika su
određene pomoću metoda opisanih u LACREMED smernicama o analitičkim metodama za određivanjen sadržaja ksenobiotika.
Degradation of xenobiotics by fungal strains of Ganoderma resinaceum and G. adspersum with and
without mediator
Xenobiotikumok lebontása Ganoderma resinaceum és G. adspersum gombatörzsek által mediátorral és
mediátor nélkül
Degradacija ksenobiotika od strane gljivičnih sojeva Ganoderma resinaceum i G. adspersum sa i bez
medijatora
REFERENCES/LITERATURA/IRODALOM
ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W., LIPMAN D.J. (1990) Journal of Molecular Biology 215, 403-10.
BALDRIAN P. (2006) FEMS Microbiolological Review 30, 215-242.
BOLLAG J.-M., SHUTTLEWORTH K. L., ANDERSON D. H. (1988) Applied and Environmental Microbiology 3086-3091.
CAMARERO S., IBARRA D., MARTÍNEZ M.J., MARTÍNEZ A.T. (2005) Applied and Environmental Microbiology 1775-1784.
KIISKINEN L.-L., RÄTTÖ M., KRUUS K. (2004) Journal of Applied Microbiology 97, 640–646.
KIISKINEN L.-L., VIIKARI L., KRUUS K. (2002) Applied Microbiolology and Biotechnology 59, 198-204.
SHLEEV S.V., MOROZOVA O., NIKITINA O., GORSHINA E.S., RUSINOVA T., SEREZHENKOV V.A., BURBAEV D.S., GAZARYAN I.G., YAROPOLOV A.I. (2004)
Biochimie 86, 693-703.
TÉLLEZ-TÉLLEZ M., SÁNCHEZ C., LOERA O., DÍAZ-GODÍNEZ G. (2005) Biotechnology Letters 27, 1391-1394.
WEI H-R, RHOADES M.G., SHEA P.J. (2011): Formation, adsorption, and stability of N-Nitrosoatrazine in water and soil. In: It’s all in the water: studies of
materials and conditions in fresh and salt water bodies; BENVENUTO M., et al.; ACS Symposium Series; American Chemical Society: Washington, DC,
2011.
WHITE T.M., BRUNS T., LEE S., TAYLOR J. (1990): Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA for phylogenetics. In: INNIS M.A., GELFAND
D.H., SNINSKY J.J.,
WHITE T.J. (Eds.). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, San Diego, CA, pp. 315-321.
6