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FRET Fluorescence Resonance Energy Transfer Förster Resonance Energy Transfer 시스템생물학과 2011161025 김효인 Theodor Förster 독일 물리화학자 주요 업적: FRET FRET에서의 Forster radius도 이 사람의 이름을 따서 붙여짐 형광(Flourescence) photon molecule in ground state photon molecule in excited state light can induce transitions between electronic states in a molecule intersystem crossing S1 internal conversion fluorescence absorption the Jablonski diagram T0 -hν internal conversion +hν S0 radiationless transition transition involving emission/absorption of photon Aragonite Characteristic property • Maximum excitation and emission wavelength (nm) • Quantum yield • Lifetime (ps) • Stokes shift Stokes Shift • Emitted fluorescent light has a longer wavelength and lower energy than the absorbed light 2 common reasons • Non-radiative decay to the lowest vibrational level of the excited state • Highest vibrational level of the ground state FRET 488nm light excitation excitation FITC FITC TRITC TRITC 520nm light 630nm light Energy Donor excitation state dipole-dipole interaction Emission Acceptor excitation state ㅈ Jablonski diagram • Resonance energy transfer can occur when the donor and acceptor molecules are less than 100 A of one another • Energy transfer is non-radiative which means the donor is not emitting a photon which is absorbed by the acceptor • Distance dependent interaction between the electronic excited states of two molecules -Donor-Acceptor의 Energy transfer는 거리에 의해 효율이 결정 (~10nm) Calculation ∗ 𝐷 ,𝐴 𝑘𝑇 → (𝐷, 𝐴∗ ) FRET • 𝑘 𝑇 : 특정 Donor – Acceptor 쌍 사이의 FRET 반응속도상수 𝑘 𝑇 는 또 이렇게 표현 가능한데, 𝜏𝐷 는 Acceptor가 없을 때의 Donor의 Fluorescence Lifetime을 의미함. R은 두 분자간의 거리 𝑅0 는 𝐅𝐨𝐫𝐬𝐭𝐞𝐫 𝐫𝐚𝐝𝐢𝐮𝐬 (에너지전달효율이 50%일때의 거리) 𝑅0 는 각 분자의 Spectral property와 dipole 방향에 의해 이러한 식으로 구할 수 있음. • 𝜅 2 : 쌍극자의 방향 요소 ( 0~ 4) • n : 굴절률 • J(𝜆) : 스펙트럼 중첩 적분 값 • 𝜙𝐷 : Donor의 양자수율 • Typical values of R0 Donor Acceptor Ro(Ǻ) Fluorescein 55 IAEDANS Tetramethlrhoda mine Fluorescein EDANS Dabcyl 33 Fluorescein Fluoresscein 44 BODIPY FL BODIPY FL 57 Fluorescein Qsy7&Qsy9 dyes 61 46 • 𝑘 𝑇 는 하나의 FRET 쌍에 대하여 적용되는 것으로 측정할 때는 각 FRET 쌍들의 거리 와, 방향분포들이 적합하게 평균되어 나타 난다 • 실제 실험에서 FRET을 통하여 얻는 정보는 FRET 효율(E)를 측정함으로써 Donor와 Acceptor 사이의 거리를 유도해내는 것이 다. • 𝜏𝑀 : Acceptor 분자가 있을 때 Donor 분자의 Fluorescence Lifetime • 정류상태(Steady-state) 측정방법 • 𝐹𝐷 : 정류 상태에서 Acceptor가 없을 때 의 Donor 형광 세기 • 𝐹𝐷𝐴 : 정류 상태에서 Acceptor가 있을 때 의 Donor 형광 세기 FRET summary • Non-radiative dipole-dipole interaction인데 dipole이 vector이기 때문에 Donor와 Acceptor의 상대적인 dipole 방향도 중요 • Emission of the donor must overlap absorbance of the acceptor • R<10nm • Detect proximity of two fluorophores upon binding 일반적인 응용 • FRET현상이 거리에 매우 dependent ->측정하고 싶은 물질에 형광물질을 달아 거리 변화를 정밀하게 측정할 수 있음. -> 단백질의 특정 위치에 형광물질을 달아 FRET이 일어나는 정도를 측정해 두 분자간 거리를 알아내고 여러 위치에서 거리를 재 단백질의 모양을 유추할 수 있음. 일반적인 응용 • Protein 간 association을 확인할 수 있음. ex) 항원 – 항체반응 단백질 – 효소 반응 • 추적하고 싶은 물질과 이동할 것이라 예상 되는 경로에 형광물질을 달아 물질의 이동 을 추적할 수 있음. FRET studies of interaction and dynamics (molecular ruler) Association of two biomolecules Dynamics of a biomolecule 학교 제도 : 교육 제도 중 학교에 관한 제도 사회적으로 가장 먼저 공인된 제도, 형식적 교육 제도 1) 서구 사회의 학교 제도 - schola : 한가, 여가를 뜻함, 오늘날의 학교 school -고대 그리스 사회에서 지배계급의 지위와 신분을 유 지하기 위해 소수의 귀족계급을 위해 조직되어 교육 실시 -중세 유럽사회의 학교는 소수의 성직자나 지도자 양 성 을 위한 교회부속의 사원 학교가 대부분 FRET • Biological application using FRET