Transcript 2. Neinvazívna prenatálna diagnostik... 722KB Dec 04 2014 03:06

Neinvazívna
prenatálna
diagnostika
Mgr. Kristína Kypusová 1
MUDr. Silvia Javorková 2
Doc. RNDr. Erika Halašová, PhD. 1
Prof. MUDr. Ján Danko, CSc. 3
1 Ústav
lekárskej biológie JFMED UK
2 Detská klinika UVN nemocnica SNP, Ružomberok, FN JFMED UK
3 Gynekologicko-pôrodnícka klinika JFMED UK
cff DNA
• 1997 Lo et al. popísal prítomnosť cff DNA (cell free fetal DNA) v
maternálnej plazme
• Pohlavie plodu
• Preeklampsia
• RhD status plodu
• Včasný odber genetického materiálu (5.týždeň gestácie)
• Falošne pozitívne výsledky 5-9%
•
Úspešnosť detekcie 85-90% (Spencer et al., 1999, Wald et al., 2003,
Go et al., 2005)
• Vysoká stabilita cff DNA, odolnosť voči vonkajšej teplote prostredia a
transportu (Clausen et al.2013)
Ct hodnoty
Fetálna DNA
Celková DNA
Dni po odbere periférnej krvi
Graf č.1 Vplyv transpotru vzorky periférnej krvi
na koncentráciu cff DNA (Clausen FB, Jakobsen
TR, Rieneck K, Krog GR, et al. (2013) PreAnalytical Conditions in Non-Invasive Prenatal
Testing of Cell-Free Fetal RHD)
• Nie je signifikantný rozdiel v kvantite
fetálnej DNA počas dní transportu
• Hodnota celkovej DNA- detekcia
GADPH (gén pre glyceralhehyd 3fosfát dehydrogenázu) (n=110)
• Hodnota fetálnej DNA- detekcia RhD
génu (n=52)
• n= fetálna DNA/celková DNA 2. deň
n=0/3, 3.deň n= 4/10, 4.deň n= 8/17,
5.deň n= 10/20, 6.deň n= 12/29,
7.deň n=12/20, 8.deň n=4/8, 9.deň
n=2/3
Cff DNA geq/ml
• Hodnoty cff DNA
boli stanovené
pomocou
univerzálnej
štandardnej krivky
• Hodnoty cff DNA
priamoúmerne so
zvyšujúcim sa
gestačným vekom
• Po 30. týždni
výrazný rast
hodnôt cff DNA
GA pri odbere vzoriek periférnej krvi matky
Graf č.2 Hodnoty cff DNA počas gestácie
(Clausen FB, Jakobsen TR, Rieneck K, Krog GR, et al.
(2013) Pre-Analytical Conditions in Non-Invasive
Prenatal Testing of Cell-Free Fetal RHD)
Genetický materiál pre NIPD
(non-invasive prenatal diagnostic)
1. cff DNA/RNA
• Fragmentované úseky
• <300bp
• 3-10% z celkového množstva cff DNA v plazme
(19% (Lun et al. 2013)
• 85-90% úspešnosť detekcie
2. intaktné fetálne bunky
• r. 2003 Intact fetal cells in maternal
plasma: are they really there? (Bischoff
et al.)
• 1bunka/1mL
• 50% úspešnosť detekcie
PLACENTA
FETÁLNA
DNA/RNA z
APOPTOTICKÉO
TROFOBLASTU
FETÁLNA mRNA
r. 2000(Poon
et.al.)
RNA
izolácia
Digital PCR
Taqman sondy
Absolútna
kvantifikácia
DETERMINÁCIA KVANTITY
SLEDOVANEJ VZORKY
SPOČÍTANÍM POZITÍVNYCH
SIGNÁLOV (JAMIEK ČIPU)
FETÁLNA cffDNA
DNA
izolácia
RT PCR
Taqman sondy
AMPLIFIKÁCIA ŠPECIFICKY
OZNAČENÝCH CIEĽOVÝCH
ÚSEKOV, KVANTITU JE MOŽNÉ
SLEDOVAŤ V EXPONENCIÁLNEJ
FÁZE
METÓDY
IZOLÁCIA cff DNA
• Optimalizácia metódy pre vyšší výťažok
Vzorka v K3-EDTA skúmavkách,
1
Centrifugácia 2x 10min. pri 2200 rcf
Oddelená plazma odobratá bez porušenia
bunkovej časti krvi
2
3
Fixácia formaldehydom
Komerčne dostupný kit, silikátová membrána
(QIAamp DSP Virus Kit- QIAGEN)
METÓDY
RT- PCR
• KVANTITATÍVNE VYŠETRENIE (preeklampsia, dvojnásobne väčšia
koncentrácia cff DNA v plazme matky- zrýchlená apoptóza
syncítiotrofoblastu) (Kamhieh-Miltz et al. 2014)
• KVALITATÍVNE VYŠETRENIE (RhD genotypizácia u Rh- negatívnych
žien) (Lun et al. 2008)
• Absolútna a relatívna kvantifikácia
• Vysoká senzitivita
LIMITY
• FP VÝSLEDKY (parazitické dvojča)
• FN VÝSLEDKY (mozaicizmus, kontaminácia)
• Nedokážeme detegovať DEFEKTY NEURÁLNEJ TRUBICE
(nepostačuje vyšetrenie Alfa Feto Proteínu- vysoké hodnoty)
• Detekcia mutácii spôsobených duplikáciami a inzerciami
obmedzená VEĽKOSŤOU cff DNA
• KOMPLIKOVANEJŠIE SPRACOVANIE vzoriek mRNA
• KONTAMINÁCIA maternálnou DNA
BENEFITY
• NEINVAZÍVNOSŤ a komfort odberu
• Získanie KOMPLEXNÝCH INFORMÁCII o genetickom stave
plodu a VČASNÁ PREVENCIA pred dedičnými a imunitnými
ochoreniami plodu
• Časová a finančná NENÁROČNOSŤ METÓDY (komerčne
dostupné kity)
• NÍZKY GESTAČNÝ VEK odberu vzorky (už od 5.týždňa gestácie)
• Koncentráciu cff DNA NEOVPLYVŇUJE DĹŽKA TRANSPORTU, ANI
VONKAJŠIE TEPLOTY PROSTREDIA (Clausen et al., 2013)
APLIKÁCIE NIPD/ PRÍTOMNOSŤ
• RhD STATUS plodu (HDFN), včasné podanie antiD- imunoglobulínu
• Detekcia POHLAVIA PLODU (SRY gén, DYS14 gén)
• Vyšetrenie PREEKLAMPSIE (kvantitatívna RT- PCR)
APLIKÁCIE NIPD/ BUDÚCNOSŤ
RIEŠENIE- EPIGENETICKÉ MARKERY, FETAL SPECIFIC MARKERS
metylácia maternálnej a fetálnej DNA
hPL, PLAC gény, SNP mRNA
• Prístup k celému FETÁLNEMU GENÓMU
• Rutinné prenatálne vyšetrenie V KLINICKEJ PRAXI (bez invazívnych
metód)
• Monogénne AUTOZOMÁLNE OCHORENIA- zatiaľ len detekcia
paternálnej alely
• ANEUPLOÍDIE
• Hemoglobinopatie (β- TALASÉMIA)
• X- VIAZANÉ GENETICKÉ OCHORENIA- detekcia prítomnosti Y
chromozómu
Ďakujem za pozornosť!