Epigenetisch epidemiologisch onderzoek

Rudolf Talens PHD epigenetische epidemiologie Dept. Molecular Epidemiology Leiden University Medical Center

Opbouw presentatie

• Epigenetica wat is het • Epigenetisch onderzoek • Epigenetica in epidemiologisch onderzoek • Epigenetica in de klas 2

•

Wat is Epigenetica

Wat denken jullie?

3

Biochemische benadering

2 m chromosoom in celkern < 10 µm Opvouwen (CONDENSATIE!) Ruggengraat = PO 3  Neutraliseren Wikkelen rondom histon eiwitten http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=gbSIBhFwQ4s Histonen + DNA = nucleosoom Kleine chemische groepen aan Histon staarten Attractie, hogere condensatie  gesloten chromatine Repulsie, minder condensatie  open chromatine Condensatie beperkt toegankelijkheid transcriptie Het hele genoom niet gelijkmatig gecondenseerd 4

Fysiologische benadering

• • • • • • Ons lichaam bestaat uit vele cel typen Functioneel en morfologisch heel anders Allemaal uit één zygote  zelfde genoom Niet-genetische Informatie voor cel identiteit Epi = op!  boven-genetische informatie Embryogenese en differentiatie kennen enorme epigenetische veranderingen (Reik, 2007) 5

•

Biologische benadering

Niet elk gen / allel komt tot expressie – Gen expressie verschillen tussen isogene individuen – Bv 1e gekloonde kat (cc, DNA donor: rainbow) – Beide lapjeskatten, let op vacht!

• • • X-chromosoom inactivatie In vroege ontwikkeling één allel uitgezet Willekeurige beslissing wordt correct doorgegeven – Zorgt voor mozaïek (lapjes patroon vacht) – Gekloonde Lapjeskatten ander vacht patroon 6

•

Wat is epigenetica?

Biochemische informatie op en rondom het DNA dat plaatselijk de mate van condensatie van het chromosoom bepaalt • • • • • Onafhankelijk van de genetische code Programmeerbaar gedurende ontwikkeling en cel differentiatie Mitotisch overerfbaar Stabiel in gedifferentieerde cel Verandering blijft mogelijk – Aanpassing gen expressie aan omgeving 7

•

Definitie

Mitotisch overerfbare verschillen in gen expressie potentiaal die niet worden veroorzaakt door verschillen in de genetische code (Jaenisch & Bird, 2003) 8

•

Epigenetische informatie

Verschillende gecorreleerde lagen / vormen 9

Epigenetische regulatie gen expressie

M --CG- --GC- M

DNMT

miRNA

MBP

Transcriptionally

silent

DNA

Exon 1 Exon 2 HDAC HDAC

Methylated Lys9 on H3

Transcription Activator complex

Transcriptionally

active

DNA

Exon 1 Exon 2

Acetylated H3 Methylated Lys4 on H3 https://www.youtube.com/watch?v=29doT6Hf2MI&feature=player_detailpage 10

• •

Epigenetische mechanismen

Vergelijk genetische code met computer code Dan is epigenetische code besturingssysteem • Epigenoom is dynamisch (i.t.t. genoom) – Omgeving heeft invloed • • • Geïnduceerd  fysiologisch proces (bv wondgenezing) Gericht  aanpassing aan omgeving (bv eetgedrag) Willekeurig  schade (bv toxische blootstelling) – Willekeurige veranderingen zonder omgevingsinvloed • Incorrect epigenetisch onderhoud 11

Gen



Omgeving

 12

Concepten rondom epigenetica

• Welke concepten zijn er nu voorbij gekomen?

• Welke had je al bedacht?

• Welke zijn er nieuw?

13

• •

Epigenetisch onderzoek

Meten epigenetische informatie DNA methylatie (CpG sites) – meest onderzochte laag van epigenetische informatie – Methyl gevoelige restrictie enzymen – Methylated DNA immuno precipitation Verouderd – Bisulfiet (BS) behandeling Meest gebruikt • Histon modificaties – Technisch steeds meer mogelijk – CHIP: chromatine immuno precipitation (sequencing) 14

Meten DNA methylatie (BS)

• Bisulfiet creëert artificiële SNP – Ongemethyleerde C wordt U (T) – gemethyleerde C blijft C – Detecteren met gangbare sequencing technieken BS PCR • DNA methylatie: – 1 molecuul: binair (wel of niet) – 1000 moleculen: (0 % – 100 %) – 2 allelen / cel, meten 500 cellen – – Kwantitatieve variabele Inter-individuele variatie Talens et al., Faseb J. 2010 15

•

Meten DNA methylatie

Epigenetisch onderzoek complexer dan genetisch – 1 lichaam, 1 genoom, geen weefsel verschillen – 1 leven, 1 genoom, zelfde genen van geboorte tot dood – Elke Levensstijl, 1 genoom, wat je doet beïnvloed genen niet – – Elke ziekte, 1 genoom, ziekte veranderd je genen niet (causatie) Sequentie humaan genoom bekend – UCSC genome browser 16

•

Epigenetisch onderzoek

Humaan epigenetisch onderzoek lastig – Veel genetische variatie – Beperkt aantal weefsel beschikbaar voor onderzoek – Geen controle over levensstijl / leef omgeving • Dier modellen – Inteelt populatie, geen genetische variatie – Controle over omgeving – Elk weefsel op elk moment toegankelijk 17

• •

Dier modellen: de Agouti muis

Normale expressie agouti gen – Kort in haar follicel voor gele gloed op zwart haar Toevallige transposon insertie creëerde alternatieve promoter in niet coderend deel – Expressie A vy via ps1A promoter mogelijk in elke cel – Afhankelijk van ps1A DNA methylatie 18

•

Dier modellen: de Agouti muis

Inteelt model voor epigenetische regulatie – Isogene individuen – DNA methylatie  fenotypisch verschil – Vachtkleur en obesitas = observeerbaar fenotype – Fenotypisch spectrum gecorreleerd aan epigenetica unmethylated methylated Waterland & Jirtle

MCB

2003; Dolinoy et al.

EHP

2006 19

• •

Dier modellen: de Agouti muis

DNA methylatie ps1A promoter prenataal beïnvloedbaar (folium) Verschuiving vachtkleur nest Waterland & Jirtle MCB 2003 • • Eiwit deficiëntie ook Hersteld met folium Dolinoy et al. EHP 2006 20

• •

Andere diermodellen

Schapen folium arm dieet in pre implantatie fase: – blastulas van controle en dieet moeders werden op overgebracht en geïmplanteerd in baarmoeder van normaal gevoede schapen (Sinclair PNAS 2007) Folium arm dieet geassocieerd met – Genoom wijde epigenetische verschillen in foetus – – Vettere mannetjes (22 mnd.) met minder spier massa Slechtere insuline respons • Ratten – Prenatale calorische restrictie tegengesteld effect van prenatale eiwit restrictie op zelfde genen (PPARα en GR) 21

•

Epigenetica en stress?

Rat model kinderverwaarlozing – Minder moederzorg  hogere stress respons – Hogere DNA methylatie Glucocorticoid receptor – – Gekruiste opvoeding zelfde effect Weaver et al. Nat Neurosci 2004.

Terugdraaien met inhibitie histon deacetylase • • Zelfde mechanisme in muizen a.g.v. stress vroeg in leven – Methylatie gen arginine vasopressin Murgatroyd et al. Nat neurosci 2009 Ook in mensen a.g.v. kindermishandeling – Hersenen van zelfmoord slachtoffers

• •

celkweek

DNA methylatie verandert willekeurig 2 Cellijnen in kweek – Zelfde originele cel – Zelfde omstandigheden – 100 + passages Landan et al. Nat Genet 2012 23

• • •

Humaan epigenetisch onderzoek

Humane interne weefsels na operatie of autopsie Populatie studies  – epidemiologie Historische gebeurtenis (b.v Hongerwinter) – Familie studies (bv Tweelingen) – Klinische cohorten (bv hartinfarct Meestal slechts 1 bloedmonster / deelnemer beschikbaar!

• Voorwaarden epigenetische epidemiologie – Wat je meet is niet / weinig veranderd met de tijd – – Wordt niet beïnvloed door de uitkomst (bv ziekte) Is wat je kunt meten gerelateerd aan de ziekte • WEEFSEL VERSCHILLEN!

24

• •

Voorwaarden voor epidemiologie

Wat zegt DNA methylatie in bloed nou?

8 kandidaat loci voor CHD getest – Stabiliteit over 10 – 20 jaar – 2 weefsels (bloed en wangslijmvlies) Locus IGF2R LEP CRH IGF2 APOC1 Correlation 0.88

0.90

0.94

0.92

0.96

Talens et al., Faseb J. 2010 Locus IGF2R LEP CRH APOC1 Correlation 0.83

0.80

0.91

0.82

25

•

Autopsie studies

Overeenkomsten tussen bloed en interne weefsels?

– Genoom wijde patronen, weefsels verschillen – Per CpG site, – 30 % correlatie > 0.75 bloed en één intern weefsel Talens et al., UNPUBLISHED 26

•

Hypothese

Developmental Origins of Health and Disease • Epidemiologische studies: Associatie CHD risico en slechte condities rondom geboorte – Klein bij geboorte – Historical events (e.g. famine) – Dierstudies impliceren epigenetische mechanismen DOHaD Gametogenesis Conception Birth Growth Adulthood Ageing Adverse conditions Coronary Heart Disease

• • •

De Hongerwinter Familie Studie

Eind WW2, voedsel embargo west Nederland Verschrikkelijke episode, maar overeenkomsten met interventie studie diermodellen Individuen blootgesteld rondom geboorte getraceerd en 2000 1500 Dec 1944 Jan 1945 Feb 1945 Mar 1945 Apr 1945 May 1945 Famine period Famine period (Last menstrual period) Lumey et al., Int J Epidemiol 2007 0 1000 500 28

•

Epigenetica gevoelig voor hongerwinter

Prenataal blootgesteld vs zus of broer (zelfe sexe) – 7 / 16 loci verschilden – Associaties waren sexe en timing specifiek – 6 Meer aan de hand dan folium deficientie 4 2 0 -2 -4 -6 2x10 -6 6x10 -5 3x10 -6 Gene IGF2 GNAS INSIGF IL10 LEP ABCA1 3x10 -3 8x10 -4 8x10 -3 Early Late Gender 2x10 -5 F M M

IGF2 IL10 GNASAS INSIGF2 LEP ABCA1 MEG3

29 Tobi et al. Hum Mol Genet 2009

IGF2 IL10 GNASAS INSIGF2 LEP ABCA1 MEG3

•

Gevoeligheid rondom conceptie

Van gametogenese tot aan embryogenese – Epigenetische herstructureringen – Beslissingen over cel identiteit 30

Epigenetica gedurende levensspanne

18 50 Adult lifespan 88 NTR DTR • Nederlandse eeneiige tweelingparen (NTR) 66 MZ twin pairs (< 30 years) • Deense eeneiige tweelingparen (DTR) 67 MZ twin pairs (> 73 years) Talens et al., Aging cell 2012

Ouderen hogere epigenetische variatie

* P < 0.05

*** *** *** *** *** *** *** *** ** P < 0.01

*** P < 0.001

** ** *** ** *** *** *** *** *** Talens et al., Aging cell 2012

•

Epigenetische variatie binnen MZ paar

Epigenetische tussen individuen en binnen tweeling paren hoger op oude leeftijd ** *** *** *** ** *** *** *** ** Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetica gedurende levensspanne

18 50 Adult lifespan 88 NTR DTR • • NTR Biobank project (NTR) 66 MZ twin pairs (< 30 years) 67 MZ twin pairs (> 73 years) NTR 61 NTR MZ twin pairs (30 - 65 years) 2 weinig toename in variatie:

KCNQ1OT1

25 NTR MZ twin pairs (> 65 years) and

GNASAS

3 grote toename in variatie:

IGF2DMR

,

LEP

and

CRH

Talens et al., Aging cell 2012

•

Epigenetica gedurende levensspanne

Epigenetische variatie lijkt geleidelijk toe te nemen * ** *** *** *** Talens et al., Aging cell 2012

Longitudinale follow-up op hoge leeftijd

18 50 Adult lifespan 88 NTR DTR NTR NTR 19 DTR MZ twin pairs 73 – 81 years old at first sampling Blood samples from 1997 and 2007 DTR 1997 DTR 2007 Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetische variatie na 10 jaar follow-up

• Toename in epigenetische variatie blijft tot op hoge leeftijd geleidelijk doorgaan * Talens et al., Aging cell 2012

• •

Epigenetica en CHD

Honger winter studie Prenatale blootstelling verhoogd risico op – Hart en vaat ziekten – Metabole ziekten – Schizofrenie – Epigenetische veranderingen  CHD?

DOHaD Gametogenesis Conception Birth Growth Adulthood Ageing Adverse conditions Coronary Heart Disease 38

•

Epigenetica en CHD

Klinische studie op hartinfarct – 124 cases vs 126 controls, Geen eerdere CHD icidenten – Verhoogd risico door bloedwaarden, BMI, roken – Hartinfarct (MI) gedurende 3 jaar follow up • 6 Loci, prenataal gevoelig voor hongerwinter DOHaD Gametogenesis Conception Birth Adverse conditions Growth Adulthood Ageing Coronary Heart Disease 39 Talens et al., Int J Epidemiol 2012

•

Associatie epigenetica en MI

Sex specifieke associatie DNA methylatie insuline en G-receptor-α-anti-sense • • Associatie onafhankelijk van CHD risico factoren

Locus

INS GNASAS

Sex

♂ ♀ ♂ ♀

Mean (SD) % methylation

76.0 (5.1)

% meth

− 0.4 (0.87)

Standardized

− 0.07

75.5 (4.2)

49.3 (6.6)

48,4 (7.0) + 2.5 (0.76)

+ 0.2 (1.12)

+ 4.2 (1.28) + 0.59

+ 0.03

+ 0.60

p-value

0.659

0.002

*, p < 0.05

**, p < 0.01

***, p < 0.001 40 Talens et al., Int J Epidemiol 2012

Epigenetische epidemiologie

Epigenetische mechanisme geven een geloofwaardig moleculair mechanisme waarmee de associatie tussen ouderdomsziekten en vroege (prenatale) omgeving, en levensstijl.

Wetenschappelijk bewijs neemt toe!

Gametogenesis Conception Birth Growth Adulthood Ageing 41

Many thanks

• • • • • • LUMC, dpt. Cardiology, The PROSPER Group Prof. Dr. W. Jukema and Dr. S Trompet LUMC, dpt. Medical statistics and bioinformatics Prof. Dr. Hein Putter, Dr. J. Goeman LUMC, dpt. Molecular epidemiology Dr. B. Heijmans, Prof. Dr. E. Slagboom, Dr. S Bos, Dr. I. Meulenbelt, Drs. E v.d. Akker, Dr(s). E. Tobi, Drs. M Drijfhout v Hooff, Drs. H. Suchiman, D. Kremer, R. v.d. Breggen N. Lakenberg and W. de Dijcker LUMC, dpt. Pathology Dr. J Bovee, R. Guijt, T. Alberts, E. Dreef Nederlands Tweeling Register (Prof. Dr. D Boomsma, Dr. A Willemsen) Danish Twin Registry (Prof. Dr. K Christensen, Prof. Dr. L. Christiansen)

Epigenetica in de klas

• Zoeken naar – Aansprekende en illustratieve voorbeelden – Projecten, experimenten en excursies • Nog een vraag – Prenatale adaptatie ….. – Wat of wie denken we dan aan?

43

Doorgeven van verkregen eigenschappen

• Evolutie – Populatie – Vele generaties – Genetische code • Adaptatie – Individu – Enkele generaties – Epigenetische code?

Plaatje vrouw / generaties Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829)