Transcript Prezentacja programu PowerPoint

Oddziaływanie ludzkiej
topoizomerazy I z białkami
Krzysztof Staroń
styczeń 2006
C
B
A
Problemy topologiczne
dwuniciowego DNA
Ludzkie topoizomerazy
Mechanizm relaksacji
DNA przez
topoizomerazę I (1)
Mechanizm relaksacji DNA przez
topoizomerazę I (2)
Kamptotecyna
Topotecan (Hycamtin®)
Irinotecan(Camptosar®)
1
Struktura ludzkiej
topoizomerazy I
215
NT
434
Cap
636
713 765
Subdomain III
CR
LK CT
Aktywności
topoizomerazy I
Nacinanie
DNA
CPT
+
1
215
NT
434
Cap
636
713 765
Kinazowa
Subdomain III
CR
LK CT
Relaksacyjna
ASF/SF2
pBR322
Substraty aktywności kinazowej
topoizomerazy I
Splicing factor SFRS4 (SRp75)
Splicing factor SFRS6 (SRp55)
Splicing factor SFRS5 (SRp40)
Splicing factor ASF/SF2 (SRp30a)
Splicing factor SC35 (SRp30b)
Splicing factor SFRS9 (SRp30c)
P P P P P P P
| | | | | | |
...SYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSR...
A.Identyfikacja partnerów
białkowych
ludzkiej topoizomerazy I
MS analysis
Koimmunoprecypitacja
SDS-PAGE
Koimmunoprecypitacja
200
Poliklonalne przeciwciała
anty-topo I
1
215
NT
434
Cap
636
713 765
116
97
66
Subdomain III
CR
LK CT
45
31
D N A PK
U 5 sn R N P 2 2 0
U 5 sn R N P 2 0 0
to p o is o m e ra s e
N D H II
PA R P 1
to po is o m e r a se
PSF
G u h e lic a se
hnR N P R
p72
hnR N P U
p54
hnR N P K
Ig G h e a v y c h a
N F AT 4 5
A c tin
hnR N P C
n u c le o p h o s m i
h n R N P A 2 /B 1
hnR N P A 1
hnR N P A 0
H uR
SF2 /A SF
Ig G lig h t c h a in
U 2 p o lip e p tid e
h is to n e H 1
Chromatografia
powinowactwa
MS analysis
SDS-PAGE
Chromatografia
powinowactwa
SDS-PAGE
resin
HeLa
nuclear extract
M.W.
+
1
215
434
Cap
NT
636
Subdomain III
CR
LK CT
GST
-
+
-
+
-
+
-
+
-
+
713 765
-
+
1
Identyfikacja
partnerów
topoizomerazy I
B23 nucleophosmin CAA34809
DNA-PK
A57099
DEAH 68 protein
1406327A
H1d
NP_005310
H1X
NP_006017
hnRNP A1
P09651
hnRNP A2/B1
NP_112533
hnRNP C
NP_004491
hnRNP R
NP_005817
hnRNP U
S22765
Hu R
NP_001410
Ki-67
P46013
NDH II
Q08211
Nopp140
P41777
nucleolin
NP_005372
p120
AAA36398
PARP-1
P09874
RH II/Gu
AAF78930
RH p72
Q92841
SF2/ASF
Q07955
TCOF1
AAH27252
Topo II 
A40493
U2snRNP A'
NP_003081
U5snRNP 100
AAB87902
U5snRNP 116
Q15029
U5snRNP 200
NP_054733
U5snRNP 220
NP_006436
215
NT
Ribosome biogenesis
Transcription, DNA repair
RNA metabolism
Chromatin structure
Chromatin structure
RNA metabolism
RNA metabolism
RNA metabolism
RNA metabolism
RNA metabolism
RNA metabolism
Proliferation
RNA metabolism
Nucleologenesis
Ribosome biogenesis
Proliferation
DNA repair
RNA metabolism
RNA metabolism
RNA splicing
Ribosome biogenesis
Topology control
RNA splicing
RNA splicing
RNA splicing
RNA splicing
RNA splicing
434
Cap
636
713 765
Subdomain III
CR
LK CT
Fibrillarin
AAH19260 RNA processing
N-acetylotransferase BAB13995 Acetylation
B23 nucleophosmin
DEAH 68 protein
H1d
H1X
hnRNP A1
hnRNP A2/B1
hnRNP A3
hnRNP C
hnRNP K
hnRNP L
hnRNP R
hnRNP U
Hu R
NDH II
nucleolin
p54nrb
PARP-1
PSF
RH II/Gu
RH p72
SF2/ASF
SF3b130
SF3b155
Topo II 
CAA34809 Ribosome biogenesis
1406327A RNA metabolism
NP_005310 Chromatin structure
NP_006017 Chromatin structure
P09651
RNA metabolism
NP_112533 RNA metabolism
AAQ63629 RNA metabolism
NP_004491 RNA metabolism
P61978
RNA metabolism
P14866
RNA metabolism
NP_005817 RNA metabolism
S22765
RNA metabolism
NP_001410 RNA metabolism
Q08211
RNA metabolism
NP_005372 Ribosome biogenesis
Q15233
RNA splicing
P09874
DNA repair
CAA50283 RNA splicing
AAF78930 RNA metabolism
Q92841
RNA metabolism
Q07955
RNA splicing
NP_036558 RNA splicing
NP_036565 RNA splicing
A40493
Topology control
Białka oddziałujące z topoizomerazą I
zidentyfikowane we wcześniejszych pracach
Znalezione w tej pracy:
H1d
H1x
nucleolin
PARP-1
PSF
p54nrb
SF2/ASF
fibrillarin
Nieznalezione w tej pracy:
ARF
CK2
PCNA
RNA polymerase II
TBP
topors
WRN
p53
Wzajemne oddziaływania między białkami
wiążącymi się do topoizomerazy I (baza HPRD)
fibrillarin
NDHII (DDX9)
B23
RHp72 (DDX17)
H1d
nucleolin
RHp68 (DDX5)
DNA-PKcs
PARP-1
H1x
hnRNP U
hnRNP K
hnRNP C
p54nrb
U2snRNP A’
U5snRNP 116
hnRNP R
hnRNP L
hnRNP A1
SF3B 155
U5snRNP 100
Hu R
hnRNP A2/B1
SF3B 130
SF2/ASF
PSF
RHII/Gu (DDX21)
Topo II
U5snRNP 200
U5snRNP 220
hnRNP A3
Ki 67
N-acetylotranferase
Nopp 140
TCOF 1
p120
Funkcje białek wiążących się do
topoizomerazy I
Ribosome biogenesis
and nucleologenesis
DNA repair
Proliferation
Chromatin structure
Other
Splicing and
RNA metabolism
215
434
Cap
B. Białka wiążące się do
rejonu cap
215
B23 nucleophosmin
H1X
hnRNP A1
hnRNP A2/B1
hnRNP A3
hnRNP C
hnRNP K
hnRNP L
hnRNP R
hnRNP U
Hu R
NDH II
nucleolin
PARP-1
p54nrb
PSF
RH II/Gu
RHp68
RH p72
SF2/ASF
SF3b130
SF3b155
Topo II 
434
Cap
Białka wiążące się do
rejonu cap i posiadające
tandem domen RRM
215
434
Domena RRM
Cap
Wiązanie RNA
Wiązanie białek UHM
215
Białko SF2/ASF
434
Cap
DGPRSPSYGRSRSRSRSRSRSRSRSNSRSRSYSPRRSRGSPRYSPRHSRSRSRT
1
120
195
248
215
434
Mapowanie miejsc wiązania białka
SF2/ASF na topoizomerazie I
215
1
215
434
636
636
713
?
1
215
713 765
NT
215
434
434
636
Cap
434
Cap
636
713 765
Subdomain III
CR
LK CT
215
Mapowanie miejsc wiązania
topoizomerazy I na białku SF2/ASF
215
1
Cap
434
Cap
195
1
120
195 248
1
control
1
434
765
1
195
120
120
195 248
195
215
Dokowanie białek z tandemem
RRM na topoizomerazie I
SF2/ASF
434
Cap
p54nrb
215
434
Cap
Dokowanie SF2/ASF na topoizomerazie I
bez DNA i w obecności DNA
- DNA
+ DNA
215
Konkurencja między tandemem
RRM a DNA: wiązanie do cap
GST
215
434
GST
+
DNA
+
DNA
434
Cap
215
Odwracanie nacinania DNA
przez SF2/ASF
SF2/ASF
-
+ camptothecin
434
Cap
Konkurencja między tandemem
RRM a DNA: hamowanie nacinania
DNA w obecności kamptotecyny
215
control
434
Cap
Wzajemne hamowanie aktywności
SF2/ASF
topoizomerazy I przez - + camptothecin
substraty obu reakcji
215
Relaksacja
H
DNA
CPT
Fosforylacja
434
Cap
215
434
Cap
Wybór białek do analizy Y2H
hnRNP A1
hnRNP A2/B1
hnRNP A3
hnRNP L
Hu R
p54nrb
PSF
SF2/ASF
hnRNP R
nucleolin
fibrillarin
NDHII (DDX9)
B23
RHp72 (DDX17)
nucleolin
RHp68 (DDX5)
H1d
DNA-PKcs
PARP-1
H1x
hnRNP U
hnRNP K
hnRNP C
p54nrb
U2snRNP A’
U5snRNP 116
hnRNP R
hnRNP L
hnRNP A1
TCOF 1
p120
N-acetylotranferase
Topo I
hnRNP A3
U5snRNP 200
U5snRNP 220
Ki 67
Nopp 140
SF3B 155
U5snRNP 100
Hu R
hnRNP A2/B1
SF3B 130
SF2/ASF
PSF
RHII/Gu (DDX21)
Topo II
1
215
NT
C. Białka wiążące się do
domeny N-końcowej
Phage display (PhD)
1
215
NT
DNA sequencing
1
PhD dla domeny N-końcowej
KLWVIPQ
KLWVIPQ
KLWVIPQ
KLWVLPK
KLWVLPK
KLWQVFP
KVWILTP
KVWTIPR
KVWYITP
KVWDLRS
KCCYIPT
KCCYIPT
KCCYIPT
KCCYIPT
KGPPITR
YVTREPR
Ky[WC]xxP
DNA-PK
215
NT
1
Indukcja apoptozy przez DNA-PK
215
NT
1. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Piekiełko A., Staroń, K. (2002). SF2/ASF
protein inhibits camptothecin-induced DNA cleavage by human
topoisomerase I. Eur. J. Biochem. 269, 3504-3510.
2. Trzcińska, A.M., Girstun, A., Kowalska-Loth, B., Staroń, K. (2002)
Potential protein partners for the N-terminal domain of human topoisomerase
I revealed by phage display. Mol. Biol. Rep. 29, 347-352.
3. Czubaty, A., Girstu, A., Kowalska-Loth, B., Trzcińska, A.M., Purta, E.,
Winczura, A., Grajkowski, W., Staroń, K. (2005) Proteomic analysis of
complexes formed by human topoisomerase I. Biochim. Biophys. Acta 1749,
133-141.
4. Kowalska-Loth, B., Girstun, A., Trzcińska, A.M., Piekieko-Witkowska, A.,
Staroń, K. (2005) SF2/ASF protein binds to the cap region of human
topoisomerase I through two RRM domains. Biochem. Biophys. Res.
Commun. 331, 398-403.
Agnieszka Girstun, Alicja Czubaty, Krzysztof Staroń, Agata M. Trzcińska,
Barbara Kowalska-Loth
oraz: Wojciech Grajkowski, Aleksander Jamsheer, Agnieszka Piekiełko-Witkowska,
Elżbieta Purta, Alicja Winczura