Transcript DIAGNOSTICO ASPERGILOSIS IVAN

Índice
01 ASPERGILOSIS
1.1 DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO
1.2 EXAMEN DIRECTO
1.4 DETECCION DE ANTIGENO
1.4.1 INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
1.5 CULTIVO
1.6 DIAGNOSTICO SEROINMUNOLOGICO
02 DETERMINACION DEL ANTIGENO DE
GALACTOMANANO EN SUERO
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Ivan Fernández Fernández
01 / ASPERGILOSIS
Micosis causadas por hongos filamentosos del género Aspergillus. La
localización más importante, por frecuencia y gravedad, corresponde
a la aspergilosis sistémica, profunda o invasiva, en la que el pulmón
es el órgano afectado con mayor frecuencia. Existen unas 20 especies
potencialmente patógenas humanas.
Las principales son A. fumigatus, A. flavus, A. niger, A. terreus, A.
glaucus, A. versicolor y A. nidulans.
A. terreus
A. glaucus
A. fumigatus
A. flavus
A. nidulans
A. niger
A. versicolor
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1.1/ DIAGNOSTICO MICROBIOLOGICO
La aspergilosis invasiva es una de las complicaciones infecciosas más graves en pacientes
hematológicos. Sin embargo, el diagnóstico de certeza es difícil, ya que los procedimientos
invasores y la toma de biopsias pueden estar contraindicados por el mal estado clínico o
hematológico de los pacientes (insuficiencia respiratoria, trombocitopenia grave,...). A su vez, el
diagnóstico precoz es de capital importancia para mejorar los resultados terapéuticos, por lo que la
posibilidad de detectar con rapidez el antígeno galactomanano de Aspergillus ha generado grandes
expectativas. Por todo ello, la detección de galactomanano en suero se está generalizando como
una herramienta útil en el diagnóstico precoz y en el seguimiento de la aspergilosis invasora.
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1.3 / EXAMEN DIRECTO
La observación de filamentos fúngicos y ausencia de blastosporas en muestras
respiratorias de calidad, aunque no resulta específica de Aspergillus spp., puede
orientar hacia un diagnóstico de aspergilosis, especialmente en pacientes
neutropénicos.
En cuanto a las muestras, resultan muy indicadas el lavado bronquial, lavado
bronco alveolar y cepillado bronquial y en menor medida, el esputo.
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1.4/ DETECCION DEL ANTIGENO
La posibilidad de detectar algunos componentes de la pared del hongo en el suero del
enfermo mediante técnicas sensibles ha cambiado notablemente el panorama actual .
Los dos marcadores más importantes disponibles son:
- EL GALACTOMANANO (antígeno galactomanano), un componente de la pared
celular de Aspergillus fumigatus que puede determinarse mediante una prueba
inmunoenzimática muy sensible que es capaz de detectar valores de hasta 0,5
microg/ml.
- EL (1-3)-BETA-D-GLUCANO, que a diferencia del anterior no resulta específico de
Aspergillus.
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1.4.1/ INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
Consideraciones:
•
Se recomienda la determinación bisemanal de galactomanano, durante la fase más
crítica de su enfermedad.
•
Un valor aislado positivo no debe ser interpretado como sinónimo de aspergilosis
invasiva. En este caso, conviene repetir la determinación.
•
La sospecha de aspergilosis invasiva guarda relación con la elevación progresiva y
mantenida de los valores de antígeno galactomanano.
•
La Determinacion de galactomanano presenta un valor predictivo negativo (VPN)
elevado (95-98%) en pacientes neutropénicos, lo cual le confiere una gran utilidad,
pues un resultado negativo permite descartar casi con absoluta seguridad una
aspergilosis invasiva.
•
La determinación sistemática de antígeno galactomanano en estos pacientes
permite evaluar la respuesta a los tratamientos antifúngicos y, eventualmente,
modificarlos.
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1.5/ CULTIVO
El cultivo de muestras sobre todo respiratorias, resulta especialmente útil para el
diagnóstico de las aspergilosis.En cualquier caso, el aislamiento de Aspergillus spp. no
es criterio de enfermedad.
En relación con el cultivo, cabe destacar la importancia de emplear varios medios y
diferentes condiciones de incubación, especialmente a distintas temperaturas (26, 37 y
45 ºC). Las especies que se desarrollan únicamente a 25 ºC no se consideran patógenas.
La incubación a 45 ºC resulta especialmente útil, pues permite, por una parte, informar
de un resultado precoz a las 24 horas de cultivo y además, seleccionar las especies
termófilas, más relacionadas con un comportamiento patógeno.
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1.6/ DIAGNOSTICO SEROINMUNOLOGICO
En la actualidad es importante cuando se emplea simultáneamente con la
determinación de antígeno galactomanano, pues permite valorar el resultado en ciertas
situaciones de casos antígeno negativo y presencia de anticuerpos (complejos
inmunitarios).
Más recientemente se ha introducido una técnica de enzimoinmunoensayo que
presenta una elevada sensibilidad, y que podría resultar útil en el diagnóstico de la
aspergilosis invasiva, pues aproximadamente un 30% de estos pacientes presenta
niveles considerables de anticuerpos.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN
SUERO
Preparamos los controles R3, R4 Y R5 y las muestras de la siguiente
manera:
1- Añadimos 300 microlitros de cada uno en un tubo eppendorf es
decir, 300 microlitros de R3 en un tubo, 300 microlitros de R4 en otro
tubo……
•
En cada uno de los tubos añadimos 100 microlitros de R7.
•
Agitamos en el vórtex cada uno de los tubos y los
calentamos en el termoblox durante 6 minutos a una temperatura
de 120 º centígrados, una vez concluido este tiempo centrifugamos
los tubos a durante 10 minutos.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN
SUERO
2- Sacamos las tiras necesarias dependiendo del número de muestras
teniendo en cuenta que 4 pocillos van a utilizarse para los controles (R3,
R4, R4, y R5) y preparamos la microplaca de la siguiente forma:
•
En cada pocillo echamos 50 microlitros de R6 previamente
homogeneizado por inversión .
•
Ahora añadimos 50 microlitros del sobrenadante de los
reactivos y muestras previamente centrifugadas y homogeneizamos la
mezcla de cada uno de los pocillos.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN
SUERO
3- Una vez preparada, tapamos la placa con la tira adhesiva que viene en el
KIT y la incubamos en la estufa a 37º centígrados durante 1hora y 30
minutos.
*mientras incubamos la placa y antes de pasar el siguiente paso debemos
preparar la solución WASH el cual contendrá 4 ml de R2 por tira + 76 ml de
agua destilada por tira .
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN
SUERO
4- Procedemos al lavado de la microplaca en el LAVADOR DE GALACTOMANANO de la siguiente
manera:
•
Encender el aparato cerciorándonos de que el tubo que posee el aparato en la parte de
atrás este conectado en la garrafa marcada como RINSE.
•
Colocamos la microplaca en la bandeja de manera que el pocillo A quede situado en la
esquina superior derecha
•
El siguiente paso es seleccionar mediante las flechas que aparecen en la pantalla de LED
las siguientes opciones de forma consecutiva; YES, RUN, YES, ahora seleccionamos la opción TO2
N5BO, 55 que es la opción del GALACTOMANANO y por ultimo volvemos a seleccionar la opción
YES.
•
Ahora el aparato nos preguntara cual es el número de tiras que deseamos lavar,
seleccionamos el número adecuado y pulsamos YES.
•
Volverá a cambiar la pantalla la cual ahora mostrara el siguiente mensaje, WASH este es
el momento de desconectar el tubo que estaba enchufado a la garrafa de RINSE y conectarlo a la
garrafa en la que se puede leer WASH, una vez echo esto volvemos a seleccionar en la pantalla de
LED la opción YES.
•
El aparato comenzara a trabajar realizando 5 lavados consecutivos automáticamente
•
Una vez el aparato concluya de lavar la microplaca retiramos la misma y pulsamos ESC.
•
Ahora procedemos al lavado del aparato seleccionado con el cursor de la pantalla de LED
la opción RINSE con lo que debemos de volver a desconectar el tubo de la parte trasera del
aparato y esta vez pasarlo de la garrafa de WASH a la de RINSE, una vez echo esto pulsamos YES
(realizar 5 lavados del aparato consecutivamente los cuales entre uno y otro debemos pulsar la
opción YES ya que no los realiza consecutivamente de forma automática).
•
Por ultimo introducimos la bandeja pulsando IN y apagamos el aparato.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
5- Una vez lavado procedemos a la mezcla del R9 del cual añadiremos 200 microlitros en cada
uno de los pocillos, una vez realizada la mezcla dejaremos la microplaca durante 30 minutos a
temperatura ambiente en condiciones de OSCURIDAD.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
6- Una vez trascurridos los 30 minutos debemos añadir 100 microlitros de R10 el cual lo
debemos de mezclar bien ya que esta reactivo es el que detiene la reacción que se esta
produciendo en cada uno de los pocillos
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
7- El último paso es leer los resultados en el LECTOR DE GALACTOMANANO siguiendo los
siguientes pasos:
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Conectamos el aparato pulsando el botón que se encuentra situado en la parte trasera del
mismo.
•
En la pantalla de LED aparece “UNIDENTIFIED USB DEVICE”; lo eliminamos con el aspa de
cerrar.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Ahora podemos ver que el aparato nos pide el usuario y la contraseña para acceder a las
opciones, una vez introducidas correctamente pulsamos OK.
•
Aparecerá el menú principal y automáticamente se abrirá la bandeja donde se depositara
mas adelante la microplaca.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Ahora hay que crear una lista de trabajo eligiendo la opción “CREAR O MODIFICAR UNA LISTA
DE ID DE MUESTRA”.
•
Pinchamos “>>”.
•
•
Por defecto aparece marcado “CREAR NUEVA”, a continuación volvemos a pinchar “>>”.
Entonces aparecerá la casilla “REGISTRO MANUAL DE LA LISTA DE ID DE MUESTRA” sobre la
que debemos pinchar.
•
Por defecto aparece marcado “UNA”, nosotros pinchamos” OK”.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
•
•
•
En la pantalla aparecerá “EDITAR DATOS DEL POCILLO” y se observa una placa microtiter.
Para introducir los datos de las muestras en cada pocillo se pincha en cada cuadrado de la
microplaca virtual la cual simula la verdadera. Cada cuadrado corresponde a un pocillo sobre
el que se pincha y se escribe el número de muestra que corresponde, entonces pinchamos”
OK “y saltará automáticamente al siguiente cuadrado en el que deberemos actuar de la
misma manera hasta registrar todos los datos de cada uno de los pocillos
Al finalizar volvemos a pulsar “OK” y se mostrara la opción “GUARDAR LISTA” la cual se
guardara nombrándola con la fecha del día de la realización de la prueba.
Pinchamos en “FINALIZAR”
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Aparecerá de nuevo la pantalla del menú principal, donde una de las opciones que se
mostrara será la de “INICIAR MEDICION” sobre la que pincharemos.
•
Elegimos el nombre del archivo el cual en este caso será la opción “60” la cual corresponde a
“ASPERGILLUS” y pulsamos”>>”.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Colocamos la microplaca.
•
Aparecerá otra ventana de iniciar medición con un mensaje, el cual no debemos de tener en
cuenta asique volvemos a presionar “>>”.
•
De nuevo aparecerá una ventana de iniciar medición, con el método que
vamos a utilizar “ ASPERGILLUS”, debajo podemos escoger la lista de trabajo
creada anteriormente , nos situaremos sobre la misma y pulsaremos “
INSERTAR”, “OK”, ahora saldrá una placa de microtiter en la pantalla y
volvemos a pulsar ”OK”
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Aparece de nuevo la pantalla de iniciar medición y pinchamos “FINALIZAR”.
•
Comienza el agitado automáticamente.
•
El espectrofotómetro introduce y lee la microplaca.
•
Aparecerá una pantalla de error en la cual se pregunta si deseas realizar los cálculos
igualmente, nosotros debemos pinchar “SI”.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
Se imprime un informe con los resultados.
•
Extraemos la microplaca.
•
Aparece un nuevo mensaje en la pantalla y pulsamos “FINALIZAR”.
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02/ DETERMINACION DE ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN SUERO
•
•
•
El aparato retornará a la pantalla del menú principal donde veremos la opción “SALIR DE
MAGELLAN” sobre la que pincharemos.
Por ultimo saldrá una ventana con el mensaje “AHORA ES SEGURO APAGAR EL LECTOR
¿REINICIAR AHORA?”, entonces debemos apagar el equipo del botón situado en la parte
posterior del aparato directamente ya que si pulsamos el “OK” que aparece en la pantalla de
LED se volverá a reiniciar al programa.
8- El último paso es informar los resultados, introducimos en el programa de validación de
resultados como NO (en caso de ser negativos) o como PO (en caso de ser positivos).
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