Transcript Enzimas de Restricción
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
BIOL 3306 – LAB DE GENÉTICA JA CARDÉ, PHD UPR – AGUADILLA
OBJETIVOS
Al completar esta los estudiantes presentación podrán:
• Definir lo que son las enzimas de restricción • Describir los criterios para su nomenclatura • Explicar los factores que afectan la actividad de estas.
• Mencionar algunas aplicaciones de importancia de estas.
• Preparar una reacción de digestión de DNA con enzimas de restricción
• • • •
INTRODUCCIÓN:VECTORES
70’s: se crean exitosamente las primeras moléculas recombinantes Se ligan fragmentos de DNA de orígenes distintos Se logra introducir moléculas recombinantes dentro de células
• • • •
Una vez en célula huésped,
se replica produce varias copias idénticas del gene se expresa esto se le llama
clonación.
• • • •
INTRODUCCIÓN: VECTORES
Para clonar un gen la fuente para el gen es el DNA cromosómico del organismo que lo tiene.
• • • Para hacerlo llegar al interior de la nueva célula hay que usar un vehículo o vector Los vectores comúnmente usados en experimentos de clonación derivan de plásmidos o de virus La mayoría son plásmidos, pequeños, circulares, naturales en algunas células, confieren fenotipos observables Ori Secuencias marcador MCS
VECTOR
• • • • •
ENZIMAS
P roteínas Aceleran reacciones químicas Reducen la E de activación E + S
ES
E + P
• • • • • • • •
Ejemplos
Proteasas Lipasas amilasas Dehidrogenasas Girasas Ligasas Peptidasas NUCLEASAS
• • • • •
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN
Descubiertas 1970, Daniel Nathans Cortan el enlace azucar-fosfato del DNA, en ambas cadenas Aisladas de bacterias, cientos Función: mecanismo de defensa de la bacteria contra DNA extraño (fagos) • • • • • Sistema de restricción/modificación Restricción/Metilación Nombre, quien la produce
EcoRI – Escherichia coli (cepa RY13) Hind II – Haemophilus influenzae XhoI – Xanthomonas holcicola
• • • • • • •
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN: PALINDROME?
• Reconocen palíndrome, específicas • Secuencia que lee lo mismo en ambas cadenas, en orientación opuesta 5’ 3’ 3’ 5’ 4, 6, 8 bp 1/256bp, 1/4096bp Isoesquisomeros ambiguos (Py-Pu) DNA learning center
•
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Cortan el enlace fosfodiester Blunts ends • • • Enzima corta simétricamente, en sitios opuestos en ambas cadenas Sticky or cohesive ends enzima corta el 5’ o desde el asimétricamente, un pedacito SS se extiende desde 3’ • 5’ overhangs • 3’ overhangs
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Cuidados: • Caras, se venden por unidades • Unidad: cantidad de enzima necesaria para digerir 1µg de DNA según las condiciones del fabricante • Sensitivas al calor • -20 o C o hielo siempre • Contaminación cruzada • Pipeteo: punta nueva siempre!!!
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Reacción, mezclar y sedimentar bien.
• • • • • DNA: limpio de contaminantes: fenol, cloroformo, etanol o sales • 1µg/µl de volumen (no mas) Amortiguador: iones, sales, pH, distintos para cada enzima • 10X 1X: dilución 1:10 con el volumen Enzima: de acuerdo al palíndrome o para averiguar si esta presente • 1U/µg de DNA Agua para completar volumen Incubadora a 37 o C por 30-60 minutos
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Factores que afectan la reacción: • • • Composición del amortiguador • Fuerza iónica: [sales] y Na o K, pH (8) Temperatura de incubación • • 37C, termofílicas a 50-65 o C Termolábiles, 25 o C Metilación • Cepa de E coli, asegurarse de su actividad de metilasas
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones • • • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector • Cortar vector y cortar inserto Mapas de restricción • Determinar lugares de restriccion para enzimas en algun vector o en una secuencia a clonar Southern Blot • Detectar la presencia de un gen o una secuencia dada en una mezcla de fragmentos de DNA cromosomal
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones • Clonar- introducir un pedazo de DNA en un vector - cortar el vector - cortar DNA fuente del inserto de interés - mezclar y ligar - transformar - cultivar en medio de selección por el antibiótico
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones • Mapas de restricción - aislar el vector con - incubar muestras de este la enzima de interés o con combinaciones de estas analizar la reacción por electroforesis (fragmentos se separan por tamaños) tamaños - comparar estos con un marcador y determinar sus deducir (lógica) el mapa del vector Tutorial
-
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones • Southern Blot Aislar genoma Cortar con enzimas Electroforesis Transferencia Incubar con sonda radioactiva Autoradiografía Cuantas copias hay en un genoma?
Hay deleciones?
Se parecen estos genes Zoo blot (parecido entre especies)
-
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Aplicaciones • Southern Blot Edward Southern -1975 cuantas copias de un gen hay en un genoma?
detección de deleciones pequeñas (diagnostico clínico) identificación de familias de genes (varios genes derivados de uno común.
identificar genes homólogos en distintas especies el gen de interés estará clonado para usarlo como sonda marcada para buscar en la mezcla de fragmentos por complementariedad
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Materiales Microtubos Micropipetas y puntas Incubadora Agua ultrapura DNA a cortar (x ugs) Buffer de la enzima de restricción Enzima de restricción Hielo
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Protocolo 1. Analizar la reacción a realizar 2. Calcular los volúmenes a servir en la reacción de cada uno de los reactivos 3. Rotular 2 microtubos 2P, etc , según aplique.
de 500µl o 1.5 ml, Control y: 1G, 1P, 2G, 4. Descongelar los reactivos a utilizar en la reacción 5. Cuidar que la enzima siempre este en hielo 6. Añadir en cada tubo, observando cuidadosamente que se mezclan, las cantidades correspondientes en el siguiente orden: • • • • Agua Buffer DNA Enzima
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN:
• Protocolo 7. Mezclar con finger-vortex 8. Centrifugar en la micro-centrifuga 30 seg 9. Incubar por 1 hora a 37 o C 10. Guardar a -20 o C 11. Analizar por electroforesis de agarosa
.
• Ejemplo de Reacción
Reactivo Conc Inicial Conc Final
Buffer DNA Enzima Agua Total 10X 4µg/µl 10U/µl 1X
Vol (µl)
4 0.5
0.5
35 40
PREGUNTAS
Como es mas específico para clonar un fragmento de DNA en un vector, con una o con dos enzimas? Porque? Mencione ventajas o desventajas de cada forma.
Si una enzima viene a 22000 U/ml, cuantos digerir 4 µg de DNA?
µl necesito para Porque las bacterias no digieren su propio DNA con sus enzimas de restricción?
Derive una formula para calcular cuantos fragmentos de DNA salen de una molécula de DNA cortada con una enzima de restricción, si la molécula es lineal vs si es circular?
REFERENCIAS
Brooker, Robert J. (2014). Genetics Analysis & Principles (Quinta Edición). New York, McGraw-Hill Companies, Inc.
. Alberts, et. Al, (2013). Essential Cell Biology, Garland Sciences Publishing, New York.
http://www.dnalc.org/resources/animations/restriction.
html http://www.restrictionmapper.org/ http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotec h/enzymes/renzymes.html