Transcript Spektrofluorometri
JURUSAN FARMASI FKIK UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
Oleh : Hendri Wasito, S. Farm., Apt.
(http : // www.hendriapt.wordpress.com)
Penyerapan energi oleh molekul memungkinkan terjadinya : ( Eksitasi, Fluorescensi, dan Fosforescensi) Banyak senyawa kimia memiliki sifat fotoluminensi (dapat dieksitasikan oleh cahaya dan memancarkan kembali sinar dengan panjang gelombang sma atau berbeda dengan semula).
Ada dua peristiwa fotoluminensi : (Fluorosensi dan Fosforesensi)
Sebagian molekul dalam keadaan ground state berada dalam keadaan singlet.
Molekul dalam keadaan : singlet : spin elektron berpasangan triplet : spin elektron tidak berpasangan
Energi keadaan triplet sedikit lebih rendah dibanding energi keadaan singlet
Merupakan suatu proses kembalinya molekul yang tereksitasi ke keadaan asas (dari S1 atau T ke S0) :
Pengendoran vibrasi (Vibrational velaxation = VR) Konversi didalam (Internal Conversion = IC) Pradisosiasi Disosiasi Konversi keluar Lintasan antar system (Inter system Crossing = IX) Pemadaman sendiri (selfquenching = SQ) Fluoresensi (F) Fosforisensi (P)
Perpindahan energi vibrasi dari molekul yang tereksitasi Molekul yang tereksitasi kehilangan energi eksitasi vibrasionalnya (lewat tumbukan) menjadi keadaan vibrasional S 2 Terjadi sangat cepat (10 -3 ) detik Dapat terjadi pada tingkat energi elektronik tereksitasi atau azas
Perpindahan energi dalam 1 molekul Elektron pindah dari tingkat energi elektronik yang lebih tinggi ke tingkat energi elektron yang lebih rendah tanpa memancarkan sinar (S2
S1 atau T2
T1) Dapat terjadi jika kedua tingkat energi elektronik tersebut berdekatan, sehingga terjadi tumpang tindih diantara tingkat energi vibrasi
Kelanjutan IC Perpindahan electron dari suatu tingkat energi elektronik tereksitasi (mis S2) ke tingkat energi vibrasi yang lebih tinggi dari tingkat energi elektronik tereksitasi yang lebih rendah
Putusnya suatu ikatan dalam molekul karena menyerap energi sinar tanpa didahului peristiwa konversi kedalam Elektron ikatan terlepas
Perpindahan energi elektronik akibat antaraksi molekul yang tereksitasi dengan molekul lain Tidak ada pemancaran sinar Energi yang dipindahkan adalah energi elektronik
Pembalikan arah spin elektron yang tereksitasi dari tereksitasi SINGLET (S) menjadi TRIPLET (T) dapat mudah terjadi jika tingkat energi vibrasi dari S overlapping dengan tingkat energi vibrasi dari T Terjadi pada molekul dengan berat molekul tinggi
Intensitas fluoresensi berkurang Terjadi akibat tabrakan-tabrakan antar molekul sendiri Adanya pemadam akan menginduksi deeksitasi dari suatu molekul analit yang tereksitasi sehingga tidak ada sinar yang diemisikan Contoh : Oksigen bagi senyawa poliaromatis hidrokarbon
Pemancaran sinar dari S 1
S 0 Waktunya amat singkat (10 -8 ) detik Jika eksitasi dihentikan,fluoresensi terhenti Emisi foton sama nilainya dengan energi ang diserap oleh suatu molekul.
Peroses sutu molekul melangsungkan suatu transisi (emisi) dari tingkat triplet ke tingkat dasar.
Pemancaran sinar dari T 1 S 0 Waktunya lebih lama (10 -4
detik) Jika eksitasi dihentikan,fosforisensi masih dapat berlangsung Biasanya didahului oleh L.A.S.
Bilangan yang menyatakan perbandingan mol yang berfluoresensi dan jumlah total mol yang tereksitasi (min = 0 dan max = 1)
Catatan Indeks : K = Tetapan Laju F = Fluoresensi IC = Konversi didalam EC = Konversi keluar IX = Lintasan antar system PD = Pradisosiasi D = Dissosiasi Faktor Lingkungan = K IC , K EC Faktor Struktur Kimia = K F , K PD dan K IX dan K D
EF lebih mungkin terjadi pada transisi
dari pada
*
n karena: * Absorptivitas molar transisi
*
jauh lebih besar dari absorptivitas molar transisi
*
n
Umur eksitasi
eksitasi n
pada K
Kix pada
*
* lebih lama dari pada umur * sehingga Kn
* lebih besar dari
* lebih kecil dari pada K IX
* , karena energi yang diperlukan untuk pembalikan arah spin pada
* jauh lebih besar dari pada n
* pada n
Nilai absortivitas molar merupakan kebolehjadian terjadinya transisi, makin besar
makin mudah terjadi transisi
makin mudah terjadi fluoresensi.
LAS lebih sulit pada
n
* Fluoresenensi
*
*, maka Fosforisensi
PF adalah proporsional dengan jumlah molekul yang tereksitasi :
dimana : PF = Intensitas fluoresensi Q f P 0 = Effisiensi fluoresensi = Intensitas yang dikenakan pada sample P = Intensitas setelah mengenai sample
Jika persamaan 3 dikembangkan dalam suatu seri maka
Jika
bc kecil maka Qf Po Σ = Effisiensi fluoresensi (nilainya tetap) = Intensitas awal (nilainya tetap) = Absorptivitas molar (nilainya juga tetap) b = Tebal kuvet (nilainya juga tetap) Sehingga persamaan menjadi :
Pf = (Nilai tetap QF, Po, Σ dan b) c = Kc
Jadi intensitas fluoresensi yang terbaca berbanding langsung dengan kadar
1. Temperatur (Suhu) a. EF berkurang pada suhu yang dinaikkan b. Kenaikan suhu menyebabkan tabrakan antar mol atau dengan mol pelarut c. Energi akan dipancarkan sebagai sinar fluoresensi diubah menjadi bentuk lain misal : EC 2. Pelarut a. Dalam pelarut polar intensitas fluoresensi bertambah, karena dalam pelarut polar b. Jika pelarut yang digunakan mengandung atom-atom yang berat (CBr 4 , C 2 H 5 I) maka intensitas fluoresensi berkurang, sebab ada interaksi gerakan spin dengan gerakan orbital elektron ikatan
mempercepat LAS maka intensitas menjadi berkurang
3. pH pH mempengaruhi keseimbangan bentuk molekul dan ionic
OH
Phenol λ λ eks = 285 em = 365 Int = 18 Phenolat λ λ eks = 310 em = 410 Int = 10 4. Oksigen terlarut Adanya oksigen terlarut dalam larutan cuplikan menyebabkan intensitas fluoresensi berkurang sebab : a. Oksigen terlarut oleh pengaruh cahaya dapat mengoksidasi senyawa yang diperiksa b. Oksigen mempermudah LAS
5. Kekakuan struktur (structural rigidity) Struktur yang rigid (kaku) mempunyai intensitas yang tinggi Bifenil Fluoren EF = 0,20 Adanya -CH2- pada fluoren menyebabkan strukturnya lebih kaku
Struktur molekul yang mempunyai ikatan rangkap mempunyai sifat fluoresensi karena strukturnya kaku dan planar EDG (OH-, -NH2, OCH3) yang terikat pada sistem
dapatmenaikkan intensitas fluoresensi EWG (NO2, Br, I, CN, COOH) dapat menurunkan bahkan menghilangkan sifat fluoresensi Penambahan ikatan rangkap (aromatik polisiklik) dapat menaikkan fluoresensi
Pengaturan pH dapat merubah intensitas fluoresensi, Contoh : Phenol menjadi phenolat
menaikkan fluoresensi
Amina aromatik menjadi ammonium aromatik menurunkan fluoresensi
Heterosiklis dengan atom N, S dan O mempunyai sifat fluoresensi
Heterosiklis dengan gugus NH, jika medianya asam akan menaikkan intensitas fluoresensi
Light source Excitation filter Excitation (prymary) filter Sampel cell light Transmitted Fluorecent (emitted) Light Fluorecence (secondary) filter Phototube Photomultiplier tube
1.
2.
3.
Kepekaan yang baik karena : Intensitas dapat diperbesar dengan menggunakan sumber eksitasi yang tepat Detektor yang digunakan seperti tabung pergandaan foto sangat peka Pengukuran energi emisi lebih tepat daripada energi terabsorbsi 4.
Dapat mengukur sampai kadar 10-4 – 10-9 M
Obat yang mempunyai sifat fluoresensi alamiah dalam hal ini tidak diperlukan tambahan pereaksi Contoh : Quinine Larutan obat ini mengabsorbsi sinar UV dan mengemisi sinar Vis
. Turunan obat yang dibentuk dengan pengikatan dengan senyawa berfluoresensi Contoh : Asam amino diikat oleh syclorida [ 5 –(dimethylamino) naphtalene-1-sulfonyl hloride]
dansyl asam aminoyang intensitas fluoresensinya tinggi SO23CL SO3-NH-CHR-COOH R=CH-C NH 2 O OH + - HCL N(CH3)2 N(CH3)2
H 3 C
Membentuk molekul berfluoresensi (a. fluorophore)
N + NH 3 S CH 2 -CH 2 OH.2CL
Fe(CN) 6 OH -- CH 2 CH 3 N N + Vitamin B1 H 3 C N N N N S CH 2 -CH 2 OH CH 3 Thiochrome Berfluorensi eks = 365 nm em eks = 440 nm
1.
Secara teoritis spektra eksitasi identik dengan spektra absorsi u.v. Spektra ini dapat digunakan untuk menentukan fosforisensi dan
yang maksimal disebut
spesifik yang menyebabkan timbulnya emisifluoresensi/ yang menimbulkan emisi eksitasi 1.
Spektra emisi adalah duplikat dari spektra eksitasi. Hanya timbul pada
yang lebih panjang.
emisi dipilih suatu
yang menimbulkan intensitas maksimal
Dibuat cuplikan dalam pelarut air, etanol, maupun sikloheksan Lar. cuplikan masukkan kedalam kuvet spektrofotometer Atur monokromator eksitasi pada suatu
didaerah u.v. (misal A).
Kemudian monokromator emisi diputar sampai diperoleh intensitas yang maksimal misal B nm (B :
emisi) Atur monokromator, emisi pada B nm dan sekarang monokromator eksitasi yang diubah sampai diperoleh intensitas yang maksimum misal A’ nm (A’ nm =
eksitasi) Monokromator eksitasi diatur pada A’ nm dan buat spektra emisi dengan merecord intensitas sebagai fungsi dari panjang gelombang (
) akan diperoleh harga
yang mempunyai intensitas maksimal misal : B’ nm Maka
eksitasi : A’ nm emisi : B’ nm
Senyawa Aspirin Bennocaine Cocaine Diazepam Iproniazid Papaverine Phenacetin Strychnin PO 4 Thioridazine
eks 240 310 240 290,325 300,370 260 410 290 335
fos 380 430 400 400,470,510 440 480 499 440 500 Waktu 2,1 3,4 2,7 0,07 1,5 1,2 Kondisi EPA Epharm Ethanol EW EW Ethanol EPA Ethanol 0,07 EW EW : Ethanol – water = 1 : 1 EPA : campuran Diethyleter-isopentane-ethanol (5:5:2)
Jelaskan penggunaan fluoresensi dan fosforesensi dalam analisis kualitatif dan kuantitatif obat atau metabolitnya ?
Suatu senyawa griseofulvin standar disiapkan pada pH 7, intensitas fluoresensinya diukur pada λ eksitasi dan emisi masing-masing pada 295 nm dan 450 nm serta memberikan data sebagai berikut : Konsentrasi (ng/mL) Intensitas fluoresensi 10 20 20 42,5 40 85 Hitunglah konsentrasi obat (dalam ng/mL) dalam sampel yang memiliki intensitas fluoresensi sebesar 64 !
HATUR NUHUN PISAN ......
Jangan lupa untuk membaca literatur lainnya baik dari buku maupun internet serta banyak latihan soal ...
Kita BISA karena BIASA ...