Transcript Молекулярно-генетические и фармакогенетические аспекты у

Санкт-Петербургский Государственный
Медицинский университет им. акад. И.П. Павлова
Кафедра госпитальной терапии им. акад. М.В. Черноруцкого
Миронова Жанна Александровна
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ
ТЕРАПЕВТИЧЕСКОЙ РЕЗИСТЕНТНОСТИ
У БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ
Научные консультанты
профессор Трофимов В.И.
чл.-корр. РАН, профессор Дубина М.В.
Актуальность
Несмотря на выявление ключевых механизмов
развития БА, успехи фармакотерапии, ТРБА
остается наименее изученной, и ситуация с
контролем БА в мире и РФ остается нерешенной
«…отличительным признаком ТРБА
является сложный контроль заболевания в
связи со сниженной чувствительностью к
терапии…» (Chung K.F., 2011)
Цель исследования
Оценить значение
фармакогенетических факторов в терапии
глюкокортикостероидами и бета2-агонистами
у больных терапевтически резистентной БА
и разработать критерии прогнозирования
терапевтической резистентности
с учетом генетических маркеров
Задачи исследования
1. Определить частоты аллелей, обусловленных мутациями С3435Т гена
множественной лекарственной устойчивости (MDR1); Gly16Arg и
Gln27Glu гена бета2-адренорецептора (ADRB2); Ile559Asn, Val729Ile,
Ile747Met, Asn363Ser, Arg23Lys гена глюкокортикоидного рецептора
(NR3C1); С–589Т гена интерлейкина 4 (IL4) и Arg130Gln (IL13) у
больных ТРБА и в контрольной группе.
2. Определить уровень экспрессии изоформ ГРα и ГРβ, кодируемых геном
NR3C1 у пациентов с БА до и после терапии ГКС
3. Выявить вклад всех вышеперечисленных генетических детерминант в
формирование патогенетических и клинических фенотипов БА, а также
их ассоциацию с ответом на терапию глюкокортикостероидами
4. Разработать алгоритм диагностики, в том числе молекулярногенетического исследования, для выявления маркерного профиля
терапевтической резистентности у больных БА
Методы исследования
Общеклинические методы
• Анамнез, физикальное исследование
Лабораторная диагностика
• Клинический и биохимический анализ крови
• Цитологическое исследование мокроты
• Гормональное исследование
• Иммунологические исследования (IL4 и IL13 сыворотке
крови (ИФА)
Функциональные показатели
• Спирография - исследование ФВД
Статистические методы (Statistica 6)
Методы молекулярно-генетического исследования
Периферическая
кровь
РНК
ДНК
ПЦР и рестрикционный
анализ (ПЦР-ПДРФ)
Стабилизация внутриклеточной
РНК, реагент «Среда-РНК»
Выделение РНК, набор
реагентов «РИБО-золь-В»
кДНК
ПЦР в режиме
реального времени
(real-time ПЦР)
Производство
ФГУН «ЦНИИЭ
Роспотребнадзора»,
Россия
Обратная транскрипция,
набор реагентов «РЕВЕРТА-L»
Амплификатор ABI 7000 («Applied Biosystems», США)
Реагенты производства «Синтол», Россия
Метод TaqMan
Эндогенный контроль: G-белок GNB2L1
Обследованные лица
Группа контроля
БА
(n=122)
(GINA 2008)
(n=103)
• возраст от 20 до 75 лет
• отсутствие курения в анамнезе
• без бронхолегочной, аллергической,
аутоиммунной и онкологической патологии
• с неотягощенной наследственностью
по аллергическим заболеваниям
Гендерный состав больных БА
Мужчины
30,3%
n=37
Женщины
69,7%
n=85
Дизайн:
случай- контроль
• жители Северо-Западного региона
• славянской национальности
• не связанные узами родства
Терапевтически резистентная БА (ATS 2000)
Большие критерии
1. Потребность в применении ТГКС > 50% времени от длительности БА
2. Необходимость использования высоких доз ИГКС (беклометазон ≥1260
мкг/сутки, будесонид >1200 мкг/сутки, триамсинолон и флунизолид >2000
мкг/сутки, флутиказон пропионат >880 мкг/сутки)
Малые критерии
1. Ежедневная потребность в длительнодействующих β-агонистах (ДДБА),
теофиллине, антилейкотриеновах препаратах
2. Ежедневные симптомы астмы, требующие применения короткодействующих
β-агонистов (КДБА)
3. Сохраняющаяся бронхообструкция ( ОФВ1< 80%, дневная вариабельность
ПСВ > 20% )
4. ≥ 1 вызова скорой помощи за последний год
5. ≥ 3 курсов терапии СГКС за последний год
6. Быстрое обострение БА при уменьшении на ≤ 25% дозы ИГКС или ТГКС
7. Жизнеугрожающие события, связанные с астмой в прошлом
Распределение больных БА в зависимости от степени
тяжести заболевания и терапевтической
резистентности
12%
(n=15)
45%
БА
(n=55)
43%
ТБА
(n=52)
ТЧБА
62% (n=76)
ТРБА
38% (n=46)
СБА
ЛБА
ТРБА
ТРБА
ТЧБА
ТЧБА
17%
22%
(n=8)
(n=17)
58%
83%
(n=38)
(n=44)
20%
(n=15)
Ген множественной лекарственной устойчивости
Ген MDR1
Эффлюкс
липофильных
соединений
транспортный
белок
Pgp-170
Апоптоз
Изменение pH
внутри клетки
С3435Т MDR1
Распределение генотипа 3435СС по гену MDR1
у больных ТРБА и ТЧБА
p=0,015
%
p=0,049
p=0,001
p=0,007
Распределение генотипа 3435ТТ по гену MDR1
у больных ТРБА и ТЧБА
p=0,005
%
p=0,007
p=0,004 p=0,008
Влияние генотипа 3435СС по гену MDR1
на риск развития БА
ТРБА
ТГКС>20
мг/сут
OR=20,89 (95% CI 5,10–85,53)
OR=6,12 (95% CI 2,42–15,48)
ТРБА
OR=5,22 (95% CI 2,11–12,92)
ТБА
OR=3,92 (95% CI 1,74 – 8,79)
БА
0
5
10
15
20
25
ADRB2 – ген бета2-адренорецептора
Ген ADRB2
2-адренорецептор
Ассоциация аллельных вариантов
Gly16Arg и Gln27Glu по гену ADRB2 с ОФВ1
у больных ТРБА и ТЧБА
p<0,001
76,22
80
77,02
75,11
p<0,001
57,81
60
p=0,020
52,77
47,40
40
80
20
60
0
16GlyGly
16GlyArg
16ArgArg
ОФВ1, %
ОФВ1, %
p=0,004
78,47
76,57
71,68
56,96
51,97
52,18
27GlnGlu
27GluGlu
40
20
ТРБА
ТЧБА
0
27GlnGln
Распределение аллельных вариантов
Arg130Gln гена IL13 у больных ТРБА и ТЧБА
ТРБА
ТЧБА
Контроль
р=0,031
Частоты аллеля
130Gln гена IL13
р=0,009
60
p<0,050
p<0,050
50
0,4
40
0,3
30
0,2
52,2
10,5
3,9
0
ArgArg
0
ArgGln
GlnGln
ол
ь
8,7
нт
р
38,8
Ко
39,1 38,2
0,1
51,3
ТЧ
БА
10
57,3
ТР
БА
20
NR3C1 – ген глюкокортикоидного рецептора
9 экзонов
Альтернативный
сплайсинг
Изоформы ГР:
Р
γ
А
α 
Экспрессия изоформ глюкокортикоидного рецептора
у больных ЛБА и СБА в зависимости от терапии ГКС
Экспрессия изоформы
ГРα
Экспрессия изоформы
ГР
До лечения
ГКС
После лечения
ГКС
120
35
30
80
105,4
60
40
20
4,2
8,8
1,3
Экспрессия ГР-бета, ед.
Экспрессия ГР-альфа, ед.
100
25
20
31,8
15
20,6
10
11,9
5
0
ЛБА
0
ЛБА
СБА
СБА
1,5
Молекулярно-генетические и клинические аспекты
ТРБА
↑ экспрессии ГР
ADRB2
27Glu
MDR1
3435C
NR3C1
363SN
ГКТ:
Длительная ГКТ
ИГКС>1200 мкг
Высокие дозы ТГКС
 кортизола
ADRB2
16Gly
ТРБА
ГКС-ассоциированные
осложнения
Фатальные
осложнения
Отягощенная
наследственность
(астматический статус)
↑ потребности
в КДБА
ДН
ОФВ1, МОС75,
SGaw
Нейтрофильное
воспаление
IL13
130Gln
IL4
-589T
Фенотип ТРБА
Женский пол
Курение
Старший возраст
ХОБЛ
Поздняя
манифестация БА
ГЭРБ
ТРБА
Ожирение
Нейтрофильное
воспаление
ИБС
Рестриктивные
изменения
Частично обратимая
бронхообструкция
ГБ
Плохой контроль
заболевания
Молекулярно-генетические механизмы развития ТРБА
Факторы внешней среды
(инфекция, аллергены, поллютанты)
NR3C1
Лекарственные мишени:
чувствительности к
глюкокортикостероидам
ADRB2
Лекарственные
мишени:
изменение функции
2-адренорецептора
ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ
РЕЗИСТЕНТНОСТЬ
мРНК
ГР α/
Персистенция
воспаления
IL4, IL13
Провоспалительные
цитокины
MDR1
Транспорт эндогенных
и экзогенных веществ
Система детоксикации
Алгоритм диагностики ТРБА
Донозологическая
диагностика БА
Стандартное
клинико-лабораторное
исследование
Трудноконтролируемая БА
Генетическое тестирование
ПЦР
Ген MDR1 (3435C)
Ген IL13 (130Gln)
Ген (-589Т)
Ген ADRB2 (16GlyArg)
Ген ADRB2 (27GluGlu)
ПЦР в реальном времени
Ген NR3C1 (изоформы ГР α/β)
Фенотип ТРБА
ГЕНОТИП
Персонифицированная терапия ТРБА
Благодарю
за внимание!