Transcript Production de l*hormone de croissance par transgénèse

Production de l’hormone
de croissance par transgénèse
Lou FREUDIGER
Jean ESNAULT
L’hormone de croissance
 Aussi appelée somatropine
 Hormone protéique de 191
acides aminés secrétée par les
cellules somatotropes de la
partie
antérieure
de
l’hypophyse, qui stimule la
croissance et la reproduction
cellulaire chez les humains et
les autres vertébrés.
 Son insuffisance empêche les
enfants d’atteindre une taille
normale.
Structure de la GH
 forme globuleuse
 structure
relativement simple :
elle comprend des
hélices et des coudes.
La structure est
maintenue par des
liaisons hydrogènes et
2 ponts disulfures
La transgénèse
Définition:
Technique servant à introduire un gène étranger dans le
génome d'un organisme, en vue d'obtenir un organisme
génétiquement modifié. Pour être réussie la transgénèse
nécessite:
- la pénétration du gène d’intérêt dans la cellule-cible
- son intégration dans le génome
- son aptitude à s'exprimer dans la cellule (production
d'une protéine)
La transgénèse
Mécanisme:
 Le gène cible, gène permettant la
production
d’hormone
de
croissance, ayant été identifié et
isolé, est inséré dans un plasmide
qui est introduit dans la bactérie
Escherichia coli.
 Les bactéries transgéniques ainsi
obtenues après multiplication, sont
placées en culture sur un milieu
approprié, dans un fermenteur.
 Puis les bactéries transgéniques
expriment ce gène et synthétisent
de l'hormone de croissance
identique à l'hormone de croissance
humaine, que l'on récupère sans
risque en vue des injections.
Première tentative
 Construction d’un gène hybride permettant à la bactérie de produire






une version presque normale de l’hGH mature.
Synthèse ADN codant les aa 1 à 24.
Ajout d’un triplet ATG en amont du premier codon.
ADN codant les acides aminés 25 à 191 a été obtenu à partir d'ARNm
de cellules hypophysaires humaines.
Clonage de ces 2 fragments en aval du promoteur lac dans un plasmide.
Introduction de ce plasmide recombinant dans E. coli où il produisait
l'hormone de croissance humaine à l'intérieur des cellules.
Inconvénients: cette hGH commençait par une méthionine qui n'était
pas séparée du restant du polypeptide par les enzymes de E. coli. De
plus, comme la protéine était synthétisée à l'intérieur des cellules, il
fallait de nombreuses étapes pour séparer l'hGH des milliers de
protéines bactériennes intracellulaires.
Seconde tentative
 Modification de la protéine de manière
à ce qu'elle soit sécrétée.
 Ligation de la séquence codante de la
protéine hGH à la séquence signal d'une
protéine bactérienne sécrétée. L’hGH
produite par les bactéries était sécrétée
dans l'espace périplasmique avec
élimination concomitante du signal
peptidique
par
une
protéase
bactérienne.
 Libération de la protéine par choc
hypotonique.
 L'hGH produite de cette manière ne
contient pas de méthionine initiatrice
puisqu'une protéase périplasmique a
coupé la séquence signal.
La transgénèse- Bilan
1.
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4.
5.
L'ARNm codant l’hGH est isolé de
l’organisme donneur. L'ARNm permet
la
synthèse
de
l'ADNc
(complémentaire) qui sera utilisé pour
le clonage. En effet, l'ADN génomique
eucaryote n'est pas utilisable dans un
système bactérien car les bactéries ne
possèdent pas la machinerie d'épissage
des ARNm eucaryotes.
L’ADNc amplifié par PCR est inséré
dans un vecteur : plasmide bactérien.
Coupure par des enzymes de
restriction et ligation de l'ADNc dans
le plasmide à l'aide d'une ligase.
Introduction du plasmide recombinant
dans une bactérie par transformation.
Les bactéries se multiplient et sont
mises en culture.
Obtention d’hGH .
L’organisme donneur
 Le fragment d’ADN de
départ est un fragment
d'ADN humain contenant
le gène de l'hormone de
croissance.
L’organisme
donneur est donc une
cellule
hypophysaire
humaine.
 Le gène impliqué dans la
biosynthèse de hGH est
situé sur le bras long du
chromosome 17
L’OGM - Présentation
L’organisme génétiquement
modifié, dans le but de produire
de l’hormone de croissance en
grande quantité, est la bactérie
Escherichia coli, de la famille des
Enterobacteriaceae.
 Les
bactéries se prêtent
particulièrement
aux
expériences de transgénèse car
il est techniquement facile de
leur faire intégrer des plasmides,
petites
molécules
d’ADN
circulaire que de nombreuses
bactéries
contiennent
naturellement.

L’OGM- Intérêts de son utilisation
 Comme
on peut cultiver des
cellules bactériennes en masse à
faible
coût,
les
bactéries
incorporant
des
gènes
recombinants peuvent synthétiser
de grandes quantités des protéines
codées par ces gènes.
 Cette méthode de fabrication
de l’hormone de croissance
est beaucoup plus productive
et plus sûre que l’ancienne. En
effet,
l’HG
était
extraite
d’hypophyses de cadavres. 1.500
hypophyses étaient nécessaires à la
fabrication d’un lot d’hormone. Et
des cas de contamination par le
prion responsable de la maladie de
Creutzfeld-Jacob ont été recensés.
Avantages par rapport à la GH
extractive:
 Facilité d’obtention
 Diminution du coût (même si il reste important)
 Diminution de l’immunogénicité
 Absence de risque infectieux
Opinion publique
 Cet OGM a bien meilleure
réputation que certains de ses
confrères. En effet, ayant un
impact favorable sur la santé,
cet OGM ne fait pas l’objet
de critiques particulières.
 L’augmentation
de
la
production de l’hormone de
croissance a engendré un
usage abusif de cette
hormone à des fins de
dopages, afin d’augmenter le
volume musculaire.
Opinion du CHMP
 Le comité des médicaments à usage humain (CHMP)
a finalisé en mai 2011, la première étape de
réévaluation du risque des spécialités contenant de
l’hormone de croissance recombinante. Le CHMP a
confirmé que la balance bénéfice-risque de ces
médicaments restait positive dans les indications et
les doses approuvées dans les autorisations de mise
sur le marché. L’Afssaps recommande aux
prescripteurs de respecter strictement les
indications et de ne pas dépasser la dose maximale
recommandée pour chaque indication.
Conclusion
 L’utilisation d’hGH synthétique a été généralisée en France à
partir de 1988, après que la méthode d’extraction de
l’hormone sur des hypophyses de cadavres ce soit avérée
dangereuse.
 Actuellement, les industries biotechnologiques produisent
l’hormone de croissance par génie génétique. C’est la
bactérie Escherichia coli qui est capable de produire cette
hormone. Une seule cuve contenant 500 litres produit la
même quantité d’hormone de croissance que 35 000
hypophyses humaines. L’utilisation d’un OGM est donc plus
sûre et diminue le coût ainsi que le temps de fabrication de
l’hGH.
Bibliographie/Webographie
 Biologie, Raven, De boeck.1279 pages
 Microbiologie, De Boeck, 1088 pages
 http://www.futura-
sciences.com/fr/doc/t/medecine1/d/hormone-decroissance_1042/c3/221/p4/
 http://ansm.sante.fr/S-informer/Informations-de-securiteLettres-aux-professionnels-de-sante/Hormone-de-Croissancerecombinante-somatropine-recombinante-actualisation-desdonnees-sur-le-rapport-benefice-risque-Lettre-auxprofessionnels-de-sante/%28language%29/fre-FR
 http://www.repere-medical.com/article-112.html