Transcript 实验十环糊精4-羟基香豆素相互作用的紫外光谱及衍生荧光法测定肉

实验十
环糊精增敏4-羟基香豆素衍
生荧光法测定肉制品中痕量
亚硝酸盐
1 实验目的
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（1）学习衍生荧光法。
（2）学习环糊精增敏荧光法的原理
2 实验原理
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亚硝酸盐是食品、环保、纺织及电镀等工业中
重要的分析项目之一。亚硝酸盐可能与蛋白质
分解产物－仲胺类物资结合，生成致癌物质亚
硝胺，食品中亚硝酸盐含量必须控制在一个很
低的水平。亚硝酸盐本省无荧光，不能用荧光
法直接测定。衍生荧光法借助一定的化学反应，
可以测定那些本身不发荧光的物质，亦可通过
衍生反应，改变被测组分的化学组成和结构，
借助于发光特性（波长、强度等）的改变，提
高测量的选择性和灵敏度。
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酸性介质中，亚硝酸根能与过量4-羟基香豆素迅速反
应形成低荧光性的亚硝基衍生物一3-亚硝基4-羟基香
豆素，该产物经 Na2S2O3还原为 3-氨基4-羟基香豆素
后，在碱性介质中能发射较强的荧光，若有适量β-环
糊精(β-CD）存在，由于β-CD对发光体的包络作用，
荧光强度大大增强，可显著提高测量的灵敏度。体系
的λ/ λ=332urn／457urn，亚硝酸盐（以 NaNO2计）
在 1～1200ng／25mL浓度范围内与荧光强度呈良好
线性关系，检出限40pg／mL。本法灵敏度高，选择性
好，可用于水样、肉制品中痕量亚硝酸盐的测定。
3 仪器与试剂
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仪器：日立 M850荧光分光光度计（或
PE LS-50B型发光光度计）：基本操作参
见附录
参数设置如下：
带通（Bandpas）：EX＝EM＝3．0nm
增益（PM gain）：Normal；
2 5mL定量试管（容量瓶）
分度吸量管。
试剂
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4-羟基香豆素溶液：用1：1（体积比）的乙腈-2mol/L
盐酸混合液配制成0.04％溶液；
NaNO2标准溶液：NaNO2（A· R级）于110○红外
灯下干燥4h后，用水配制1mg/mL标准溶液，在冰箱中
保存（每周新配一次），用时用水准确稀释到1μg/mL；
β-CD溶液：用市售品经水重结晶的β-CD配制成
0.01 mol/L水溶液；
Na2S2O3（A· R级）8％水溶液；
1.5mol/LNaOH水溶液；
pH 9.6NH4Cl-NH3·H2O缓冲溶液；
KAl（SO4）2饱和水溶液。
5 注意事项
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（1）NaNO2水溶液不稳定，其标准溶液
要新配制，并注意保存。
（2）4-羟基香豆素的亚硝基化反应要在
冰水浴中进行
（3）检出限测定中的空白实验，按规定
应做更多的次数。实验时应特别注意容
器的清洗。
6 数据处理和结果表达
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（1）选择 NaNO2含量相同的试样（如含
0.05mL 1µg／mL NaNO2标准液）实验比较有、
无β－CD时的荧光激发和发射光谱图，说明β
－CD的增敏作用。
（2）由实验数据拟合工作曲线方程，并按照
国际纯粹及应用化学联合会（IUPAC）规
定，以试剂空白荧光值的3倍标准偏差除以工
作曲线斜率，计算本法测定 NaNO2的检出限。
（3）计算加标回收率（％）和肉制品中
NaNO2含量，并与国家食品添加剂使用卫生标
准GB2760一81进行比较，判定是否合格。
7 思考题
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（1）为什么4 -羟基香豆素的亚硝基化反
应要在冰水浴中进行？
（2）从发光物质激发态的辐射和非辐射
失活的竞争，考虑环糊精对发光体系的
增敏作用和条件。
（3）为什么可用试剂空白荧光的三倍标
准差与工作曲线斜率的比值表示方法的
检出限？