Transcript Селекция сортов сои для орошаемой зоны юго-востока

МЕТОД ГОМОЗИГОТИЗАЦИИ
МАТЕРИАЛА В КУЛЬТУРЕ
ИЗОЛИРОВАННЫХ МИКРОСПОР
ЯЧМЕНЯ
Работа выполнена в рамках гранта МОН РК по теме:
«Технология культуры изолированных микроспор в
создании генетически однородных и стабильных
сортов ячменя»
№ гос. регистрации 0112РК02744
Цель исследований:
 - Повышение частоты регенерации in vitro сортов ячменя в
культуре изолированных микроспор;
 -Оптимизация параметров культуры клеток и регенерации
растений in vitro;
 - Отработка первичного протокола культуры микроспор
ячменя
Задачи исследований:

- Отбор сортов ячменя для улучшения биотехнологическими
методами. Выбор условий для дигаплодизации генотипов
ячменя в массовых масштабах.
 - Цитологические методы определения плоидности
растений.
 - Отработка эффективной технологий ускоренной
гомозиготизации генотипов ячменя (культура микроспор).
 - Разработка культур микроспор выбранных сортов,
регенерация растений, удвоение хромосом.
Сбор и подготовка колосьев
9,5-12,5 cм
16-18 cм


1. длина верхнего
междоузлия – 16-18 см,
длина колоса – 4.5-6.5 см
2. длина верхнего
междоузлия – 9,5-12,5 см,
длина колоса – 3.5-5 см
Рисунок 1.
Культура изолированных микроспор
РИСУНОК 2. Микроспоры: A - свежевыделенные; B - после деления
Развитие из культуры микроспоры
Рисунок 3.
1 – эмбриоидоподобные
структуры
(каллусы,
эмбриоиды) на
питательной среде

2 – меристематические очаги на
регенерационной
питательной среде
Развитие из культуры микроспоры
Рисунок 4.
1 – растения на
питательной
среде для
регенерации

2 - доращивание
растенийрегенерантов в
грунте
Таблица 1 – Влияние стадии развития микроспор в
пыльниках ячменя на частоту формирования
новообразований на индукционной среде В
Сорта и
линии
ячменя
Фаза развития
микроспор
поздняя
одноядерная
ранняя
двуядерная
Айдын
Байшешек
36
31
34
35
Береке 54
№275-1
39
40
35
42
% пыльников с
новообразованиями
поздняя
одноядерная
0.45 ± 0.84
0.37 ± 0.08
2.74 ± 0.108
4.57 ± 0.108
ранняя
двуядерная
0.32 ± 0.06
0.20 ± 0.14
0.27 ± 0.03
0.41 ± 0.39
Таблица 2 - Влияние источника углеводов на регенерацию
растений, сорт Байшешек
Вариант
опыта
6% сахароза
6% мальтоза
6% сахароза+
актив. уголь
Количество
Частота
Количество
новообра- регенерации
зеленых
зований,
растений
шт.
штук
%
штук
%
175
95
97
94 53,7
67,4 73,4
25 25,8
Количество
альбиносов
штук
%
75
64
10
80,5
98,4
44,1
19
2
15
19,5
1,6
56,8
Fфакт.
-
-
24,2
-
22,6
-
22,6
НСР05
-
-
12,4
-
13,1
-
13,1
Таблица 3 – Питательная среда B для
предобработки микроспор
Компоненты среды
KCl
MgSO4 x 7H2O
CaCl2 x H2O
Маннитол (0.3 M)
pH=7.0
мг/л
1490
250
150
54 630
Таблица 4 – Питательная среда А для
культивирования микроспор
Компоненты среды
мг/л
KNO3
2830
(NH4)2SO4
463
KH2PO4
400
CaCl2 x2H2O
166
MgSO4 x 7H2O
185
5 мл из 100-x MS
Fe-EDTA
B5-витамины
1 мл из 1000-x стока
B5 микросоли
1 мл из 1000-x стока
Мальтоза
90 000
МЕС буфер
1950
Глютамин
500
pH=6,2
Оценка плоидности растений-регенерантов
1

2
Рисунок 5. 1- диплоид, 2 – гаплоид
Таблица 5 - Протокол получения дигаплоидов ячменя
в культуре изолированных микроспор
1 этап – Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых
соцветий: отбор растений в поздней одноядерной стадии
развития
микроспор,
предобработка
изолированных
колосьев низкими температурами при +4°+5°C в течение 2128 суток.
2 этап - Выделение и обработка пыльников: стерилизация
колосьев, выделение пыльников на жидкую питательную
среду В. Цитологический анализ.
3 этап – Изолирование и очищение микроспор:
гомогенизация
(300об/мин
х
90сек),
фильтрация,
центрифугирование (900об/м х 3мин), флотирование
интактных
клеток
в
градиенте
20%
мальтозы,
центрифугирование (850об/м х 5мин), смешивание фракции
микроспор со средой. Инкубирование эксплантов в темноте
28 дней при 25°C.
Продолжение таблицы №5
4 этап – Деление микроспор и разбавление культуральной
среды: после 1-ой недели микроспоры начинают делиться
и образуют колонии, каллусы и эмбриоиды. В чашки
Петри добавляют среды А с уменьшенным содержанием
мальтозы (20 мг/л).
5 этап - Регенерация и укоренение: пассирование
эмбриоидоподобных
структур
на
твердую
регенерационную среду (MS соли + витамины + 0,1мг/л
зеатина + 0,01мг/л гибберелловой кислоты). Через 3-4
недели
образовавшиеся
растения-регенеранты
переносятся на среду для укоренения (1/2 MS соли +
витамины + 15 г/л сахарозы).
6 этап – Удвоение хромосом. Контроль уровня плоидности.
Пересадка в грунт, опрыскивание раствором ГК.
Получение семенного материала. Кариологический и
биохимический контроль полученных дигаплоидов.
Методика проведения НИР
- Приготовление
питательных сред и стерилизации
материала, инструментов по Ф.Л.Калинину и др.,
1980.
- Выделение микроспоры и получение гаплоидов
ячменя по методам гаплоидной технологии по
А.М.Тураеву и др., 1990; АЦФГР, 1997.
- Цитоэмбриологические анализы по методике З.П.
Паушевой, 1974.
- Статистическая обработка – В.П.Доспехов 1987;
- Выращивание донорных растений;
- Сбор и подготовка колосьев на стадии незрелых
соцветий;
- Воздействие холодом (холодовой стресс) пыльников;
- Стерилизация колосьев;
- Выделение пыльников в асептических условиях;
- Подготовка питательных сред;
- Изолирование и очищение микроспор;
- Наблюдения за делением микроспор;
- Перенос эмбриоидоподобных структур на твердую
регенерационную среду;
- Колхицинирование гаплоидных растений ячменя;
- Высадка регенерантов в грунт.
1. Заявление на патент РК на изобретение в РГКП «НИИС»
“Способ создания генетически однородных и стабильных
дигаплоидных генотипов ячменя на основе культуры
изолированных микроспор.” Регистрационный
№2013/0085.1 от 29.01.13. Башабаева Б.М., Абугалиева
А.И., Исмагул А.Ж.
 2. Башабаева Б.М. А.Ж. Исмагул, А.И. Абугалиева, Б.Ш.
Алимгазинова, Б.С. Сариев. Культура изолированных
микроспор в создании генетически однородных и
стабильных дигаплоидных генотипов ячменя
//Биотехнология. Теория и практика. Май. 2013.

СПАСИБО
ЗА
В Н И М А Н И Е!