Стабилизация двойной спирали ДНК

Что стабилизирует двойную спираль ДНК?

1) Водородные связи

A•T - 2 водородные связи G•C - 3 водородные связи

Что стабилизирует двойную спираль ДНК?

1)

Водородные связи G•C - 3 водородные связи A•T - 2 водородные связи

Важны для специфичности и стабилизации

2)

Стэкинг-взаимодействия

Стэкинг ароматических колец азотистых оснований стабилизруется гидрофобными взаимодействиями и дипольными взаимодействиями.

Различные последовательности имеют различные стэкинг взаимодействия, т.е. ароматические кольца могут иметь различный стэкинг («лучше» или «хуже).

Термодинамические параметры могут быть расcчитаны для различных динуклеотидных шагов.

Стэкинг-взаимодействия

B

Hydrogen Bonds Charge repulsion Stacking interactions

3).

Ионные взаимодействия

Основания гидрофобны; PО 2 – гидрофильны, но электростатическое отталкивание дестабилизирует двойную спираль. Для стабилизации необходимы противоионы – одновалентные катионы металлов.

4).

Гидратация.

Упорядоченная гидратная (связанная) вода (хребет гидратации в малом желобке).

Денатурация ДНК

Double-stranded DNA Strand separation and formation of single-stranded random coils Extremes in pH or high temperature A-T rich regions denature first Cooperative unwinding of the DNA strands

При нагревании две комплементарные нити ДНК расходятся – ДНК плавится

q pure DNA 70 80 90 100 T, 0 C

Энергетические характеристики структурного перехода спираль – клубок: изменение энтальпии



Н , изменение энтропии



S, изменение свободной энергии



G .



G =



Н + Т



S



Н =



С

р

dT



S =



(



С

р

/Т)dT

absorbance

Поглощение в УФ диапазоне

path length, usually 1 cm

A = ε c l

concentration сoefficient extinction

ГИПОХРОМИЗМ

Absorbance maximum for single-stranded DNA Absorbance maximum for double-stranded DNA 220 260 300 The absorbance at 260 nm of a DNA solution increases when the double helix is melted into single strands.

Денатурация ДНК

Hyperchromic effect

• bases in

ss

: • stacking of nucleotide bases decreases ε.

absorb more than bases in

ds

.

• absorbance increases as DNA denatures.

Кривая плавления



= (A - A

сп

)/(A

кл

– A

сп

),

через A сп и A кл обозначено поглощение ДНК в полностью спиральном и полностью клубкообразном состоянии, соответственно. Этот метод позволяет регистрировать



с точностью, превышающей 0,1%.



Т

пл T пл – температура середины перехода



(Т) =



Q(T)/



Q

0 кривая плавления по данным калориметрии



Т пл – температурный интервал перехода где



Q(T) =



(С р /Т)dT , (интегрирование по всему температурному интервалу)



Q 0 =



(С (интегрирование по температурному интервалу перехода



р Т /Т)dT пл )

Проанализируем еще раз силы, стабилизирующие конформацию двойной спирали ДНК.

Пусть двойная спираль является при заданных условиях равновесной конформацией и свободная энергия Гиббса Для получения такого эффекта необходимо, чтобы уменьшение энтальпии при образовании упорядоченной структуры не только компенсировало, но и заметно превосходило бы противоположное по знаку изменение энтропийного члена -T



S , вызванное уменьшением



G имеет минимальную величину.

энтропии при



Н образовании упорядоченной конформаци.

Т.е. чтобы скомпенсировать эффект увеличения порядка, атомы полимерных цепей должны взаимодействовать сильнее, чем это происходит в неупорядоченной системе.

Об взаимодействий можно судить, измеряя изменение энтальпии, энергии которое внутримолекулярных происходит при конформационном беспорядок.

переходе типа порядок Вид кривых плавления, полученный из экспериментов показывает, что кооперативные связи в макромолекуле частично разрушаются при повышении температуры, но до какого-то момента двойная спираль сохраняется.

Переход ДНК из упорядоченной структуры в неупорядоченную протекает с образованием промежуточных состояний.

При плавлении двойной спирали ДНК промежуточные состояния – это петлеобразные частично расплетенные структуры.

Термодинамически конформационный переход спираль клубок протекает как переход между двумя состояниями.

Это похоже на плавление белков с возникновением состояний типа "расплавленная глобула", но это состояние в ДНК не оказывает влияния на ход кооперативного перехода в целом, который протекает по законам перехода между двумя макроскопическими состояниями.

Процесс увеличения расплавленной области на одно звено Кооперативность переходов между формами связано с увеличением свободной энергии всей молекулы.

обусловлена тем, что образование границ

Теория кооперативных переходов, основанная на феноменологическом описании переходов с помощью статистической термодинамики, разработана достаточно полно для различных типов полинуклеотидов.

При рассмотрении переходов используют различные варианты модели Изинга в варианте, разработанном Зиммом.

Согласно этой модели причиной кооперативности плавления ДНК являются межплоскостные взаимодействия пар оснований.

Пусть пар оснований.



F

- изменение свободной энергии при межплоскостной ассоциации двух изолированных и связанных водородными связями Тогда кооперативность перехода можно характеризовать с помощью фактора кооперативности



= exp(-



F/kT)

В случае гомополинуклеотидов ширина интервала перехода связана с фактором кооперативности соотношением:



Т=(12,4



RT

2 m

/



H)



2/3 т.е. интервал перехода пропорционален



2/3

Таким образом, переход спираль-клубок у ДНК характеризуется энтальпией перехода



Н , температурой плавления Т m , интервалом плавления



Т m .

Для ДНК со случайной последовательностью оснований и примерно одинаковым содержанием ГЦ и АТ-пар (например, ДНК из тимуса теленка,) температура перехода Т m = 86 0 энтальпия перехода



Н = 8.8 ккал/моль нуклеотидов, при рН 6 и концентрации соли 0.15 М Na + . Переход типа порядок-беспорядок в НК, так же как у белков, сходен по внешнему виду с фазовым переходом первого рода, но фактически является не фазовым, а кооперативным переходом с конечным, но не нулевым, интервалом перехода.

Кооперативность связей в молекуле ДНК обеспечивается наличием вдоль водородных спиралей и связей между комплементарными основаниями двух одиночных спиралей, стэкингом оснований электростатическим отталкиванием отрицательно заряженных фосфатных групп.

Денатурация ДНК

T m is dependent on the G-C content of the DNA 50 E. coli DNA is 50% G-C Average base composition (G-C content) can be determined from the melting temperature of DNA 60 70 Temperature o C 80

Кривая зависимость тонкой структурой, если длина ДНК не превышает нескольких десятков тысяч пар оснований.

Эта проявляется на дифференциальной кривой плавления, зависимости

d(



)/dT

от

T

.

плавления  от тонкая

T

, ДНК обладает структура Конкретный плавления, который профиль отражают такие кривые, последовательностью оснований в исследуемой ДНК.

определяется Пики на дифференциальных градуса отдельных сотен пар оснований.

кривых плавления связаны с выплавлением в интервале в несколько десятых участков молекулы с размером в несколько

Дифференциальные кривые плавления для фрагмента ДНК фага fd.

Ренатурация ДНК

Denatured, single-stranded DNA k 2 Slower, rate-limiting, second-order process of finding complementary sequences to nucleate base-pairing Double-stranded DNA Faster, zippering reaction to form long molecules of double stranded DNA

Связывание лигандов с ДНК

R 1

H N O O H N N 8 9 10 7 12 11 O 6 1 2 5 4 3 N O H 2 C H 3 C H 3

R 2

Связывание лигандов с ДНК

0,4 0,2 0,0 1,0



0,8 0,6 40 DNA DNA - 6-AZC 45 50



Tm

55 60 65 70

T,oC

Связывание лигандов с ДНК

по типу интеркаляции (актиномицин D) в малом желобке (нетропсин)

Параметры связывания лигандов с ДНК (в условиях мультимодальности) Спектрофотометрия

457 нм 449 нм

Система Pf – ДНК, I=0,02М Pf – ДНК, I=0,1М Act II-ДНК Act III-ДНК n 1 2,0 ± 0,1 2,0 ± 0,1 3,0 ± 0,1 3,0 ± 0,1 K 1 (1,1 ± 0,5)·10 4 М -1 (0,8 ± 0,5)·10 4 М -1 (1,2 ± 0,5)·10 5 М -1 (1,9 ± 0,5)·10 5 М -1 n 2 7,0 ± 0,5 7,0 ± 0,5 12,0 ± 0,2 12,0 ± 0,2 K 2 (5,2 ± 0,5)·10 5 М -1 (5,2 ± 0,5)·10 5 М -1 (1,5 ± 0,5)·10 6 М -1 (1,4 ± 0,5)·10 6 М -1