Transcript Kromatografi Cair Kinerja Tinggi / HPLC

Oleh: Purwadi, M.Si.
Universitas Tulang Bawang, Bandar Lampung, 2009
Kromatografi Kolom Terbuka
Color
Sistem pemasukan sampel: manual, tidak
volumetrik  Injector
Waktu analisis lama, mengandalkan gaya
grafitasi dan kapiler  pompa
Hasil pemisahan kurang baik  pengemasan
kolom
Kesulitan Pengamatan hasil pemisahan untuk
analit tidak berwarna  Detektor
Kesulitan penghitungan kadar  integrator
KCKT dikembangkan dari kromatografi kolom terbuka
untuk menjawab kekurang-kekurangan tersebut
Injector: Sistem pemasukan sampel: sample loop dan
robotik injektor, sangat volumetrik
Pompa: Waktu analisis singkat, pengulangan/presisi baik
Kolom: baja, packing kompak, partikel sangat kecil,
tekanan dapat dibuat besar  Hasil pemisahan baik
Detektor: semua zat dapat diamati (tidak harus berwarna)
Integrator:dilengkapi komputer, bisa menghitung AuC 
mudah penghitungan kadar 
Sehingga disebut: Kinerja Tinggi
BAGAN SISTEM KCKT
detektor
kolom
injektor
pompa
oven
Wadah
solven
integrator
WADAH FASE GERAK
Merupakan tandon berisi fase gerak
Mempunyai sistem penyaring
POMPA
Merupakan sistem agar fase gerak mengalir.
Kinerja pompa yang diinginkan :
 Tekanan yang dihasilkan tinggi

Fluktuasi tekanan rendah

Kecepatan aliran fase gerak tepat
INJEKTOR: Alat untuk pemasukan sampel ke
dalam sistem KCKT
Pump
Pump
Column
Column
[INJECT]
[LOAD]
Sistem sample loop injektor
posisi load
pompa
kolom
sample loop
Posisi inject
pompa
kolom
OVEN KOLOM – instrumen pemanas
Syarat :
1. Keseragaman temperatur yang baik
2. Kestabilan temperatur yang baik
3. Ketepatan kontrol temperatur yang baik
Kolom pada KCKT
> Penampang: baja tahan karat, tahan tekanan tinggi
Ukuran partikel sangat kecil: pengepakan lebih
kompak, hasil pemisahan lebih baik
Dapat dipakai berulang
DETEKTOR HPLC
Yang umum dipakai
 Detektor Ultraviolet / Visible (UV/VIS)
 Detektor Photodiode Array (PDA)
 Detektor Fluorescence (RF)
 Detektor Konduktivitas (CDD)
 Detektor Refraktive Indeks (RID)
 Detektor Elektrokimia (ECD)
 Detektor spektrometer massa
DETEKTOR SPEKTROFOTOMETER UV/VIS
Prinsip: penyerapan sebagian energi (hv) oleh molekul
pada panjang gelombang tertentu => tereksitasi elektronik
Eksitasi elektronik
kuvet
Ein
Eout
l
Hk.Lambert-Beer
A= eCl = - log (Eout / Ein)
absorbansi
A= eCl = - log (Eout / Ein)
1
Kisaran linear
konsentrasi
Pemilihan pjg gelb.: quantitative / preparative?
275 nm
208 nm
275 nm
208 nm
Detektor Photodiode Array
Sample Cell
D2 / W lamp
Grating
satu elemen dapat
Mendeteksi absorban
Pada satu pjg gelb..
512 Elements Photodiode Array
Detektor Photodiode Array : Kromatogram 3D
Absorbansi
Spektrum
kromatogram
waktu
Detektor Photodiode Array

Puncak dapat di identifikasi dengan spektrum UV.
 Pemeriksaan kemurnian puncak dapat dilakukan.
--overlap 3 spektrum
--rasio kromatogram
--perbandingan threshold dan similarity index.
Detektor Spektrofluoresen
Excitation Wavelength
*
+ hn1
*
A*
hn1
A
hn2+
Emission Wavelength
hn2
Fluorescence
A
Rancangan Cell untuk detektor Fluorescence
Reagen derivatisasi
Reagen OPA untuk amine primer
A
CHO
+ R-NH2
CHO
o-phthalaldhyde
(OPA)
A
N-R
Reagen ADAM untuk asam lemak
+ R-COOH
CHN2
9-anthryldiazomethane
(ADAM)
CH2OCOR
Detektor Refraktive Indeks
Sistem optik
Detektor Refraktive Indeks
BAGIAN DARI SISTEM HPLC
Kromatogram gula


Analytical Conditions
 Column : Shim-pack CLCNH2
 Mobile phase : Acetonitrile /
water
=7/3
 Flow rate : 1.0 mL/min
 Temperature : Ambient
Peaks
1. Glycerol
2. Xylose
3. Fructose
4. Glucose
5. Sucrose
6. Manose
7. Lactose
Detektor Konduktifitas
V
I
A
A
L
K (conductivity) = I [A] / E [V]
=A [cm2] / L [cm] * k
(k : specific conductivity)
k= (I/E)*(L/A)
elektroda
Detektor Konduktifitas


Konduktifitas sangat dipengaruhi temperatur.
Cell harus diletakkan pada kondisi temperatur
terkontrol
Kromatogram anion dalam air laut


Analytical Conditions
 Column : Shim-pack IC-A3
 Mobile phase :
8.0 mM p-hydroxybenzoic acid
3.2 mM Bis-Tris *
 Flow rate : 1.5 mL/min
 Temperature : 40 C
 Injection Volume : 100 uL
Peaks
 1. F
(1.4 ppm)
 2. Cl
(10200 ppm)
 3. NO2
(10 ppm)
 4. Br
(43 ppm)
 5. NO3
(44 ppm)
 6. SO4
(431 ppm)
Bis-Tris : bis (2-hydroxyethyl) iminotris (hydroxymethyl) methane
Perbandingan detektor
LOD
GC
UV/ VIS RF
RID
CDD
ECD
10 ppb 10 ppt 100 ppb 10 ppb 100 ppt
Yes
Yes
No
No
No
LOD : Limit deteksi (S/N=3)
GC : Gradient Compatibility