Transcript Geneticheskaya_inzheneriya - Здравствуйте! | n

Александр Тышковский,
факультет биоинженерии и
биоинформатики МГУ, 2011
• Генетическая инженерия – использование
основ и методов молекулярной биологии и
молекулярной генетики для
конструирования организмов с заданными
наследственными свойствами.
Геном – совокупность всей ДНК
клетки.
Что же именно в геноме нас
интересует?
В случае генной инженерии это,
прежде всего, гены.
А что такое ген?
Ген – определенный участок
ДНК, кодирующий один или
несколько продуктов: ДНК и/или
РНК
Организм
Esherichia
coli
Saccharomyces
cerevisiae
Arabidopsis
thaliana
Drosophila
melanogaster
Homo sapiens
Размер
генома (н.п.)
4,6 x 106
1,2 x 107
1,2 x 108
2 x 108
3,3 x 109
Количество
генов
4000
6000
30000
13000
25000
Чемпион по размеру генома – тритон (3 x 1010 н.п.).
Одинакова ли ДНК во всех клетках нашего организма?
Нет! Ведь есть спонтанные мутации и транспозоны.
Чем больше геном, тем сложнее организм?
При этом в средней клетке нашего организма хромосомная ДНК
составляет 1% от всей ДНК. То есть во всей ДНК клетки
хромосомных генов всего 0,015%.
Поэтому без биоинформатических методов сейчас не обойтись.
Чем больше генов, тем сложнее организм?
У арабидопсиса примерно 30000 генов, у человека – 25000.
Значит, арабидопсис сложнее человека?
Нет! Ведь есть альтернативный сплайсинг (в 94% генов человека)!
• ДНК и РНК – носители генетической
информации;
• Центральная догма молекулярной
биологии: ДНК – РНК – белок;
• Свойства генетического кода;
• Открытие плазмид;
• Открытие рестриктаз;
• И многое другое.
1. Получение фрагмента ДНК;
2. Конструирование in vitro рекомбинантных
молекул;
3. Введение рекомбинантных молекул в
клетки;
4. Отбор клонов, несущих рекомбинантную
молекулу.
•
•
•
•
Химико-ферментативный синтез ДНК;
Рестрикционные фрагменты;
ПЦР;
Синтез комплементарной ДНК (кДНК) из
мРНК.
• Система модификации-рестрикции –
примитивный аналог имунной системы в
бактериях.
ДНК бактерии метилирована,
поэтому не режется
рестриктазами
ДНК бактериофага не
метилирована,
поэтому разрезается
рестриктазами
Рестриктазы = Эндонуклеазы рестрикции
• В основном, узнают палиндромные
последовательности:
• Липкие концы на 5’-конце (фосфатный):
EcoRI
5’ G A A T T C 3’
3’ C T T A A G 5’
• На 3’-конце (гидроксильный):
SphI
5’ G C A T G C 3’
3’ C G T A C G 5’
• Тупые:
SmaI
5’ C C C G G G 3’
3’ G G G C C C 5’
Вспоминаем репликацию ДНК!
1. Термическая денатурация
двухцепочечной ДНК
2. Отжиг (гибридизация) праймеров
3. Синтез ДНК (удлинение цепи)
по матрице одноцепочечной
исходной ДНК
Необходимы 2 праймера, фланкирующие
нужный участок ДНК.
Каждая цепь,
синтезированная в ходе
цикла, является матрицей
для синтеза ДНК в
следующем цикле.
Таким образом, число
продукта удваивается в
каждом цикле!
ПЦР легко позволяет
вводить в нужный фрагмент
ДНК мутацию (для этого
всего лишь нужно ввести
мутацию в праймер).
По матрице мРНК
синтезируем ДНК. Что нам
для этого нужно?
Вспоминаем, как это
делают ретровирусы или
ретротранспозоны.
Используем ревертазу
(обратную транскриптазу)
для синтеза ДНК по матрице
мРНК (в качестве праймера
– олиго(dT)).
Потом – обычную
ДНК-полимеразу.
Можно ли использовать
праймер к ДНК?
• Что такое вектор?
Вектор (векторная молекула) – молекула ДНК,
способная переносить чужеродную ДНК и
обеспечивать ее поддержание в реципиентных клетках.
Рекомбинатная молекула – вектор, в который чтонибудь встроилось.
Какие векторы есть в природе?
1. Вирусы;
2. Плазмиды.
• Плазмида – кольцевая молекула ДНК
бактерий, способная к автономной
репликации и имеющая собственный
ориджин репликации.
• Плазмиды обеспечивают один из основых
способов переноса генетического
материала у бактерий (горизонтального
переноса генов) – конъюгацию.
Часто плазмиды содержат гены устойчивости к антибиотикам.
На помощью опять приходят
рестриктазы!
Разрежем фрагмент ДНК и
вектор по одним и тем же
сайтам рестрикции, после чего
сошьем ДНК-лигазой.
Чтобы вектор не замкнулся сам на себе и чтобы фрагмент ДНК встроился
только в одну сторону, используют 2 разных сайта рестрикции.
Какие концы лучше – липкие или тупые?
Липкие! ДНК-лигазе будет куда проще их сшить (комплементарные
пары концов свяжут цепи правильным образом).
Вектор должен:
• Автономно реплицироваться в клетках
реципиента;
• Не утрачивать способность к автономной
репликации после вставки фрагмента ДНК;
• Иметь уникальный сайт клонирования
(вставки фрагмента ДНК);
• Иметь селективный маркер (желательно
внутри сайта клонирования).
1.
2.
3.
4.
Трансформация;
Электропорация;
Микроинъекции;
Инфицирование
(вирусы и фаги);
5. Бомбардировка
микрочастицами с
адсорбированной ДНК.
Здесь нам
понадобится
селективный
маркер! Лучше
всего, когда их 2:
один внутри сайта
рестрикции вектора,
другой – снаружи.
Ген вводят в один из пронуклеосов.
Интеграция трансгена происходит
случайно и может привести к
нарушению экспрессии генов и
быть летальной.
Трансген интегрирует только в
одну хромосому, поэтому
трансгенное животное является
гемизиготным.
1. Устойчивость к вредителям (ген эндотоксина,
безопасный для человека, но опасный для
насекомых) – вместо пестицидов!
2. Улучшение качества пищевых продуктов (многие растения не
содержат некоторых незаменимых аминокислот (особенно
лизина) и витаминов; некоторые вещества у нас не усваиваются
(например, растительное железо ни в каком виде у человека не
усваивается)). Получен рис, обладающий всеми этими
качествами.
3. Животные как
фармацевтические фабрики
(биореакторы) на примере
получения активатора
плазминогена.
4. GFP (green fluorescent
protein) – позволяет
следить за судьбой
белка:
- в клетке
- в организме
- и… выйти за предел
разрешения светового
микроскопа!
5. Молекулярно-биологические методы
(изучение взаимодействия белков,
нуклеиновых кислот, регуляции, выделение
и очистка белков и т.д.).
6. Лекарства против вирусов (например,
против СПИДа!) на основе активации
апоптоза вирусными протеазами.
7. Генная терапия (герминальная, соматическая).
8. Для красоты
9. И многое-многое другое!
И добро пожаловать на
факультет биоинженерии
и биоинформатики МГУ!