Transcript biosensores_4

INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA
División de Estudios de Posgrado e Investigación
INTRODUCCIÓN A LA INSTRUMENTACIÓN
“Métodos de Serigrafia para producción de Biosensores”
“Tecnicas de Fabricación y miniaturización”
Alumno:
Ing. Juan Alberto Ramírez Quintana
Docente:
M.C. José Rivera Mejia
CHIHUAHUA, CHIH.
Lunes 14 Noviembre de 2005
INSTITUTO TECNOLOGICO DE CHIHUAHUA – DEPI
CONTENIDO
2. SCREEN-PRINTING MÉTODOS PARA LA FABRICACIÓN DE BIOSENSORES
2.1 Introducción
2.2 Tecnología Screen Printing
2.4 Aplicaciones
2.6 Conclusiones
5. TECNICAS DE FABRICACIÓN Y MINIATURIZACIÓN
5.1 Microelectrodos
5.2 Microelectrodo Modificados con Enzimas.
5.3 Arreglos Miniaturizados
5.4 Agujas de Semiconductor
5.5 Membranas y Encapsulamiento
BIBLIOGRAFIA
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ANTECEDENTES
Los electrodos convencionales de Enzimas usan dispositivos voluminosos como
transductores, tales como los electrodos de oxigeno o hidrogeno. Los sensores de Electrodos o
membranas de enzimas son muy caros y necesitan mantenimiento regular. Por tanto, se necesita un Tipo
de sensor mas confiable y amigable en el mercado. Esto se realizo con la invención de Electrodo de
Enzima Mediado y la introducción de la tecnología Screen Printing.
La tecnología de Electrodo de Enzima Mediado se
demostró en 1984. La tecnología Screen-Printing se utiliza en la
industria de la electrónica y la de impresión. En 1982 esta
tecnología formo parte de los procesos de producción de
biosensores. Todos los sensores se hicieron de electrodo de
enzima y screen-Printed. Un claro ejemplo es un sensor pen-size
de glucosa
que utilizo ferrocence mediado enzimático
electroquimico y tecnología screen-printing, dando una lectura de
glucosa en forma digital en 30 s. Se considero el principio de una
nueva generación de biosensores, comercialmente viable.
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Tecnología Screen-Printing
Materiales y Métodos
2.1.1 Matriz de Sustrato. La matriz de sustrato es el material que provee la superficie para la Impresión
de la parte funcional y constructora del sensor. El costo del sustrato debe ser de Consideración. Algunos
materiales se pueden explotar para este propósito estos son:
•PVC, es el mas comúnmente utilizado por propiedades dielectricas, estabilidad, bajo costo y
trabajabilidad.
•Ceramica (Al2O3) alta resistencia, Fuerza, dureza.
•Policarbonato.
•Nitrocelulosa.
•Fibra de Vidrio.
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2.1.2 Inks. Las tintas o pastas son depositadas secuencialmente a través de “mascaras” en el sustrato de
forma estructural y funcional en las partes del sensor. Un amplio rango de pastas con diferentes propiedades
químicas (viscosidad, conductividad, resistencia termal, resistencia al agua) pueden diversificar los
requerimientos en la fabricación de Biosensores.
Se pueden clasificar en dos categorías:
Pastas Conductivas (materiales conductivos, agentes de atadura o resinas, solventes y aditivos).
Pastas Dieléctricas (Polímeros o Cerámicas).
Las pastas de carbon son muy utilizadas sobre todo en electro análisis, tienen muy bajo costo.
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Ink
Producto Comercial o Composición
Aplicación
Inmovilización
Referencia o
Proveedor
70% polvo de grafito y 30% parafina, o 60%
Electrodos de Trabajo
Aire seco o curación termal
34
Conductivo
Pasta de Carbon
polvo de grafito y 40% aceite mineral. 1-4%
si la enzima y el mediador
mediador tal como ferrocence (oxidasa) o
no son incorporados.
Azul de Meldona puede ser reducido o
incrementado trabajando potenciales 70%
polvo de grafito y 30% parafina o 60% grafito
Rellenando para track
y 40% aceite mineral.
conductivo
Carbon/grafito ink SS o Electrodag
Electrodo de Trabajo y
Aire seco o curación termal
71 oC, 2-5min
Asheson
71 oC, 2-5min
Asheson
850 oC, 30min. Al2O3
DuPont Bag
pad conductivo
Pasta de Ag
Pastas de Plata, Series Electrodag
Electrodo de Trabajo y
track conductivo
Pasta Ag-Pd
No 7474 o QM 22
Electrodo de Referencia
y track conductivo
Pasta Ag/AgCl
Homburg, Germany
Plata/Plata pastas chloride, SS y PE series
Electrodo de Referenia
71-107 C. 2-5 min
0.2 g AgCl con 1g Ag ink
Electrodo de Referencia
Aire Seco
Acheson
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Producto Comercial o Composición
Aplicación
Inmovilización
Referencia o
Proveedor
Pasta PVC
PVC ink, SS series
Capa de aislamiento
Aire Seco
Zhongvi Inks
Pastas Ceramicas
Fodel 6050 pasta dielectrica
Capa de aislamiento
80oC, 20-25 min exposición
DuPont
compatible con Au
UV por 1-3 seg. Comptible
Ink
Dielectrico
con 96% sustrato de Ceramica
de Aluminio y conductor Au.
Encapsulados
HEC
CA
3-4% (w/v) celulosa hydroxyetil agregada con
Membrana de dyalisis
triton 100 (0.01%) y polietileno glicol (3%)
externa
2% (w/v) acetato de celulosa
Membrana de dyalisis
Aire Seco
35
Aire Seco
externa
Gafquat
4% cationes de Gafquat. Gafquat 75N
Membrana de enzima
(Internations Specialty Producs Ltd).
estable
Aire Seco
36
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2.1.3 Elemento de Sensado. Cualquier enzima puede utilizarse como elemento de sensado, pero algunas de
estas son muy caras de obtener y muchas tienen muy poca estabilidad termal y el biosensor tiene que ser
constantemente calibrado. En la actividad enzimatica se puede generar error. Tienen un corto tiempo de vida.
Oxidasas y dehidrogenasas son las mas comúnmente usadas. Propiedades electromecánicas de muchas de
estas enzimas pueden ser caracterizados con electrodos como el ferrocence, benzoquinones y dyes actives.
Algunos elementos biológicos pueden ser utilizados como elementos de sensado, tales como los anticuerpos
y células microbianas.
El elemento de sensado es inmovilizado a los electrodos a través de enlace covalente, cruza
ligada, o absorción. La inmovilización puede mejorarse por técnicas de entinte (pasta) o Screen-Printing.
La pasta debe de ser cuidadosamente aplicada asegurando que el elemento sensor se disperse
adecuadamente, si no, un error puede ocurrir. Un inconveniente del método de impresión es que la gran
cantidad de pasta de enzima debe ser aplicada a tiempo, la cual no es económico a escala de laboratorio.
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Aparato
Las maquinas de Screen-Printing pueden ser horizontales, verticales o montado en escritorios. La
superficie de impresión puede ser plana, rotatoria o cilíndrica y el proceso de impresión puede ser directo e
indirecto. Para la fabricación de Biosensores el método mas conveniente es el método plano y maquina de
impresión directa. En la figura 1 se muestran las principales partes de la maquina Screen-Printing, la escoba
es movida por un elemento neumático y la velocidad de impresión es controlada por un regulador de
frecuencia.
Fig. 1 Proceso Screen printing, la presión es
Generada por un compresor.
En la impresión de chorro de tinta, el liquido abastecedor que entrega el elemento de sensado a
cada tira del sensor opera en volúmenes controlados. En la figura 2 se puede mostrar el proceso de BioJet
Quanti 3000TM (BioDot Inc.)
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Aparato
Fig 2. Diagrama de proceso Screen
Printing para preparar biosensores.
Imprimiendo Patrones
El sensor puede ser tres electrodos (electrodo de trabajo, electrodo contador y electrodo de
referencia) o una configuración de dos electrodos (sin electrodo contador). Experimentos convencionales de
voltametria ciclica, incorporan un sistema de tres electrodos mejorando el flujo de corriente a través del
electrodo de referencia.
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Imprimiendo Patrones
Si se toma en cuenta una medición múltiple, el sensor se debe de diseñar como un electrodo
patrón, multitrabajo.
•Un grupo de mascaras se hace con técnicas de fotolitografia.
•Cada mascara contiene un patron.
•Nylon, Poliéster, stainless y mallas de metal son los materiales de las mascaras.
•La malla se reviste con gel fotosensitivo con un master plate.
•El revestimiento del área del plate se solidifica, dejando revestida el área aglutinada.
•El resto es removido por un solvente. Después se lava y se seca
•Se le da mantenimiento a la mascara.
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Proceso de Impresión
En la figura 3, se muestra un diagrama del proceso de impresión tomando como ejemplo un sensor
de glucosa en configuración de doble electrodo. Los detalles son mostrados en el protocolo 1.
Fig 3. Tubo de entinte con electrodos screen printed.
El tubo inyecta la solución mediadora de enzima en
cada electrodo de trabajo. La boca se fija en la
posición mientras la plataforma mueve de derecha a
la izquierda las screen printed tarjetas de electrodo,
manejado por un motor pasos de alta resolución,
asegurando el tamaño con precisión controlada del
volumen de la solución de mediador de enzima para
ser depositado en la posición correcta de cada
superficie de electrodo.
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PROTOCOLO 1
Preparación de un por Screen Printed electrodo de glucosa
Un modelo S-600M screen Ptinted es utilizado para imprimir a través del electrodo. Todo proceso del
secado se emprende en la temperatura ambiente.
1.
Limpiar el sustrato PVC (150 mm x 150 mm x 0.5 mm) con agua, etanol anhidro, y agua destilada
secuencialmente. Cada hoja del sustrato permite imprimir un grupo de 45 sensores.
2.
Fija el sustrato de PVC limpio en la tabla de impresión de la maquina de impresión por presión atmosférica
negativa.
3.
Coloca la primer mascara, la cual es diseñada para imprimir las tiras conductivas, sobre el sustrato en la
mesa contra los registros de stop, asegurando queden los patrones exactos.
4.
Vierta la tinta de plata en la pantalla. Esparza la tinta sobre la superficie de la pantalla con el enjugador
para que la tinta sea hecha para aceptar la máscara.
5.
Dejar el solvente tinta evaporarse a temperatura ambiente. Imprimir el Pad de carbón en las tiras de plata
por el mismo procedimiento de impresión con la segunda mascara. Permitir que la tinta se seque. El pad de
carbón protege la tira de plata por oxidación a través de la exposición con el aire.
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6.
Imprimir el electrodo de referencia con la tercer mascara, aplicando una mezcla de tinta de plata con
finely ground silver chloride en radio de 2 g de Ag Cl por gramo de tinta, en el final del pad de grafito. La
tinta se deja otra vez secar en un cuarto de temperatura.
7.
Imprimir la etapa de aislamiento, con la cuarta mascara aplicando una tinta PVC, dejando las terminales y
la superficie expuestas. La superficie activa es un área circular forma un planar, electromecánica célula
de dos electrodos. Un semicírculo es el electrodo de carbón y otro es el electrodo de referencia
plata/plata chloride.
8.
Preparar una solución de ferrocencedimetanol 1.1 en agua destilada. Disolver Aspergillus Níger oxidasa
de glucosa en solución ferrocence, haciendo la concentración, haciendo la solución final a 10 unidades
GOD/ml
9.
Vierte 1-2 ml de solución en cada superficie de electrodos de carbón por uso de liquido dispensario BioDot
.
10. Los electrodos entonces permiten secar en un desecador a temperatura ambiente.
11. Imprimir el exterior de la membrana (HEC) en la superficie de la célula del electrodo cubrir la enzima y la
capa de ferrocence. La solución HEC es preparada por la mezcla 3.5% (w/v) hydroxyethyl celulosa,
0.02% Triton X100, y 3% glicol de polietileno en agua destilada.
12. Después del agua, tiene que evaporar bajo condiciones ambientales, el sensor puede almacenar sobre
gel de sílice 4oC.
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Aplicaciones
Debido a que son confiables, baratos y rápidos, los biosensores Screen-Printing han sido
reconocidos como la técnica de uso mas practico. En los últimos 10 años, biosensores Screen_printed han
sido aplicados en varios ambientes tales como:
1. Diagnostico Clinico. La importancia en el diagnostico clínico de los biosensores se ha demostrado en los
medidores de glucosa de bolsillo que hay en el mercado en muchos estilos. Con este dispositivo millones
de diabéticos pueden en casa ver los niveles de azúcar en la sangre. Un ejemplo de esto es un sensor
selectivo de glucosa hecho a base de Hexacianoferrita y GOD con pasta de carbón Con screen –Printing
se puede medir lo que es el acido urico, urea y queratina, colesterol, lactosa y creatina.
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Aplicaciones
2.
Monitoreo de Medio ambiente. Screen-Printing ofrece la facilidad de poder detectar tóxicos y
contaminantes. Ejemplo seria el efecto de pesticidas químicos en la salud humana, ya que se han
construido sensores para detectar importantes pesticidas. Se pueden utilizar para medir los niveles de
nitrogeno y evitar la eutrophicatión.
3. Alimentación y Bioprocesos. Se vio anteriormente la contribución de la medición de glucosa con
Screen-Printing, también se usa en control de bioprocesos y calidad en alimentos.
4. Seguridad y Defensa.
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Analyte
Elemento Sensor
Configuración del Eletrcodo
Performance
Referenci
a
Lactosa en Leche
b-galactosidase
Pt electrodo de trabajo
2-25 mmol/I SD: 8.81%
65
Oxidase glucosa
Ag/Pd electrodo de referencia
(n=16) estabilidad, mas
de tres meses.
Acido Lactico
Dehidrogenase Lactate NAD (+)
Meldona Azul modificada electrodo
1-20 mmol/l
de trabajo de carbon y Ag/AgCl
CV=8.7% (n=6)
34
combinado contraelectrodo/ref
Alcohol en brevage
NADH y lactosa
Alcohol dehidrogenase NAD (+)
NAD (+) y lactate dehydrogenase
Meldona Azul modificada electrodo
35 mmol/1 90%
de trabajo de carbon y Ag/AgCl
actividad residual después
combinado contraelectrodo/ref
de 40 dias.
,
NAD 3-60 mmol/l lactate
15
16
0-20 mmol/1
Acido Urico y
Xantina Oxidase
Electrodo de trabajo de carbon
1-50nmol/1 CV: 2%
62
Amyloglucosidase/glucose oxidase
Electrodos de trabajo de carbon
Maltosa, -20 mmol/l
35
(A/G)
Ag/AgCl electrodo de referencia
Glucosa, -40mmol/l
Hypoxanthine fish
freshness
Maltosa y Glucosa
CV: 3.5-5.29%
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Analyte
Elemento Sensor
Configuración del Eletrcodo
Performance
Referenci
a
Almidon de glucosa
GOD glucoamylasa
Electrodo de trabajo de carbon
Starch, 0.4% (w/v)
48
Ag/AgCl electrodo
Glucosa, -20 mmol/l
Lysina en
fermentación
Oxidas lysina incitado en hidrogel
Electrodo de trabajo de platino
de poliuretano
Ag/AgCl electrodo de
66
pseudoreferencia, contraelectrodo
de carbon
Gentamicina en
leche
anticuerpo de Anti-gentamicina
Cflujo en celulas electromecanicas
0-10 ng/kg
CV: = 132%
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Otros Enfoques
Los sensores de DNA han tenido un notable
progreso en el campo de los Biosensores. Se ha
desarrollado sensores electromecánicos de
secuencias de ADN. Con base al rastreo de
oligonuleotidos funcionan algunos sensores con
electrodos de grafito screen printing. Biomimetica
o impresión molecular ha sido reconocida como
una técnica versátil para la preparación de ciertos
polímetros. En 1990 se propuso un método de
preparación por medio de un biosensor
biomimetico.
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Conclusiones
La tecnología Screen-printing ha mostrado una gran utilidad en la investigación de Biosensores.
En los últimos 10 se convirtió en una tecnología de gran utilidad. El diseño de Biosensores puede ser mas
flexible, disponible o reutilizable, simple o múltiple propósito, superficie de sensado plana o esférica, proceso
de electrodos intermedio o directo.
Los desarrollos exitosos del sensor dependen en gran parte del costo y la estabilidad de los
elementos que presienten. Esto es un problema intrínseco de la naturaleza biológica. Muchos vectores
genéticos de la expresión se han desarrollado para la expresión de alto nivel de enzimas o de otras proteínas
que son una herramienta poderosa para el mejoramiento de la enzima hacia las propiedades deseadas.
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
Antecedentes
Hay ventajas y desventajas en la miniaturización de transductores que son utilizados como
Biosensores. Si los biosensores son destinados para mediciones de tejidos vivos, estos deben de ser
suficientemente pequeño para minimizar el daño en la célula o la micro circulación en el tejido, y además no
debe obstruir el flujo en la sangre
Los dispositivos pequeños suelen ser menos duraderos y mas fáciles de romper que los mas
grandes, las señales que generan son mas difíciles de detectar. Transductores miniaturizados, tienen un
tiempo de respuesta mucho mas rápido que los transductores grandes.
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
5.1 Microelectrodos
5.1.1 Micropepitas de Vidrio. Hay una amplia variedad de micropepitas hechas de vidrio pulled Utilizados
para medidas espaciales muy detalladas. Varias modificaciones crean muchos tipos de microelectrodos.
Algunas aplicaciones de estos son para medir potenciales y acciones potenciales en membranas intracelulares
a través de micropipetas llenas de sal fisiológica. En 1986 se utilizo por primera vez estos micorelectrodos.
En 1986 Browm y Flaming describieron las técnicas de fabricación de estas micropepitas en dimensiones
debajo de micras.
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
5.1.2 Bicelado Micropepitas de Vidrio son biseladas por dos razones:
1.la punta hacerla mas aguda para insertarla en el tejido o las células.
2.El incremento en el área de apertura baja la resistencia eléctrica de la punta o reduce la resistencia
hidráulica para las pepitas utilizando fluidos microinyectados.
Los tamaños de la punta de microelectrodos de saline_filled para el potencial de membrana de
célula o medidas neuroficsiologicas pueden ser controlados con cuidado controlando su resistencia eléctrica.
Cuando los diámetros de las micropepitas son de alrededor de 0.1 μm, la resistencia es de 150 MW, cayendo
alrededor de 20 MW cuando la talla se incrementa a 0.5 μm. hay otras técnicas donde se muelen girando
superficies sólidas.
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
5.1.3 Mediciones de Punta El limite de la resolución de un microscopio es de 0.4mm, no se puede medir
adecuadamente. Una técnica es utilizar una micrografia de electrón rastreador, aunque no funciona con
microelectrodos de vidrio. Y se genera mucha incertidumbre en algunas mediciones. Por medio del método
de conteo de burbujas se midió el diámetro de algunas puntas.
Se encontro la siguiente relación, la dimension de la punta esta dada por:
D
3.172xTensionSuperficial
p1.01
D=Interior de la punta.
P=Presion dada en Pascales
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
5.1.4 Microelectrodos de pH de Barril sencillo. Electrodos de vidrio han sido miniaturizados utilizando
diversos diseños de microelectrodos como se ilustra en la figura 5.1. En 1956, Cadwell fabrico electrodos
de vidrio de 50 a 80 μm de diámetro y midió el pH intracelular en fibras musculares de cangrejos grandes
y calamares. Un pequeño electrodo de pH fue construido en 1967, el cual se muestra en figura 5.1a tiene
una punta abierta con longitud de150 μm. En 1964 se hizo un microelectrodo de pH que se ve en la figura
5.1b, el cual ofrece mejoras significativas, el cual permite tener una resolución para mediciones de pH
intracelular.
Fig. 5.1. Esquemático de los
diferentes tipos de
microelectrodos de vidrio
sensitivo desarrollados por:
a). Hinke (1967)
b). Thomas (1974)
c). Dehemptinne (1980)
d). Javaheri at al. (1985)
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Técnicas de fabricación y Miniaturización
5.1.5 Microelectrodos de pH de Doble Barril. En 1980 se modifico los electrodos de pH de vidrio
utilizando doble Barril. Un diseño se muestra en la figura 5.1c. El diseño es una combinación del punta
recessed Thomas tipo vidrio pH con un segundo barril. Se puede colocar intracelularmente. En 1985 se
describe otro diseño, el cual se muestra en la figura 5.1d. Los métodos de construcción son mas complejos.
Un pequeño bulbo de pH sensitivo se realizo como se muestra en figura 5.1d.
La micropepita de doble barril se coloca en vidrio de Borosilicato. Un barril es utilizado de
referencia y otro de aislador. Una segunda micropepita fue colocada y la punta fue fundida con microforge.
La micropepita de vidrio se inserta dentro del barril de borosilicato de vidrio. Las dos puntas se funden
juntas por calor local con el microforge mientras se aplica presión dentro de la micropipeta de vidrio.
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5.1.6 Microelectrodo Ion-Sensitivo. Detalles de fabricación de microelectrodos ion-Sensitivos utilizan
liquido neutral cargado de ionoferas en micropepitas de vidrio. Otro tipo de microelectrodo Ion-Sensitivo
utiliza resinas de cambios iónicos, la cual suele tener una alta resistencia eléctrica comparada con el mas
reciente portador de ionophores.
Las micropepitas primero son biseladas, luego, la punta de vidrio se trata de reducir causando
una alta densidad de grupos hydroxyl en la superficie del vidrio. Esto puede ser acompañado por
salinización. Este paso de salinización, produce un enlace covalente en la superficie de vidrio, la cual
crea una interface mas estable dentro de la punta para retener el liquido portador. Este liquido se
introduce por succión o por alta presión. El microelectrodo debe de ser almacenada en la misma
solución. El tiempo de vida es limitado.
Un nuevo tipo en microhueco se diseño para transductores iónicos en 1992 por Abatí y
Moriizumi. Se combina la construcción de micropepitas de vidrio con método de fotolitografia.
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5.1.7 Mediciones de Ion y pH. Todas las micrpepitas de vidrio y microelectrodos Ion-Sesitivos, tienen alta
resistencia eléctrica. Requiriendo una alta impedancia de entrada para los amplificadores que miden su
EMF. Una desventaja de los electrodos de vidrio de pH es el tiempo de respuesta comparado con los
sensores de pH. Micropepitas de Vidrio son muy frágiles, y las mediciones no se pueden hacer en
condiciones fisiológicas donde hay mucho movimiento. Las paredes de los transductores diseñados por
Abatí y Moriizumi en 1992, tienen una baja resistencia y una baja unión de potencial, son de capacitancia
mas estable que los convencionales micropepitas de vidrio.
5.1.8 Micropepitas de Metal. Las miropepitas de metal mostradas en la figura 5.2a, son mucho mas durables
que las micropepitas de vidrio. En 1960, aparece la primera técnica de etching para producir microelectrodos
con puntos muy finos, mas pequeños que 0.1 μm. Otros han usado un proceso mecánico de dipping en
combinación con electrolisis para producir mas finos microelectrodos de metal. En 1960 Wolbarst uso en
mediciones electrofisiológicas, técnicas de etching idénticos para fabricar microelectrodos tipo aguja.
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Fig. 5.2. Esquemático de los
diferentes tipos de microelectrodos
de O2 desarrollados por:
a). Wolbarsht et al. (1960)
b). Whalen et al. (1967)
c). Tsacopoulus y Kehumenkuhler
(1977)
d). Whalen et. Al (1973)
5.1.9 Aislamiento. Después de limpiar el agua destilada y secar completamente, El microelectrodo de
metal grabado fue revestido excepto en la punta como se ve en la figura 5.2a con el vidrio calentado con
un punto de fusión en microforge. La punta se empujó en la gota fundida de vidrio, entonces la flecha
avanza con el. Para hacer el vidrio mas trabajable, es necesario incrementar el calentamiento eléctrico del
vidrio. A veces es necesario fracturar un poco una capa delgada de vidrio para que pueda pasar corriente
por la punta. Parylane es un buen aislante. Un vidrio aislante es el antimonio, el cual fue utilizado en 1968
por Vieira.
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5.1.10 Nanodos. En 1990, se modifico la técnica para micropepitas Pt de puntas descubiertas vidrio
recubierto para producir resolución espacial a escala de namometros. Estas pequeñas dimensiones de estos
ultramicroelectrodos, los cuales se les llama nanodos, fueron validados por un microscopio de rastreo de
electrones con magnificación de 50000. La técnica de fabricación es de alambrar por etching y revestimiento
de vidrio. El vidrio revestido es calentado entre 1250oC y 1370oC, luego se mueve el cable de metal etched
con a una velocidad constante en el vidrio fundido. El 10% de los nanodos exhiben sensitividad
electromecanica en radios de rango de 10 a 100 A. Corrientes medidas son muy pequeñas, aunque hay
densidades de corriente buenas, del alrededor de 70 A/cm2. Se pueden medir mejor las rápidas transferencias
con los nanodos.
5.1.11 Microelectrodos de aleación de metal recessed. El microelectrodo cátodo interrumpido de PO2
fabricados en 1967 por Whalen, combinan las micropepitas de vidrio y electrodos de metal, y producen
microelectrodos con gran flexibilidad mecánica que los metales cableados de grabado de vidrio recubierto.
Un esquemático se del diseño de microelectrodo interrumpido se muestra en la figura 5.2b. Después de
empujar fuera una micropepita de vidrio, y biselar la punta, esta se rellena con una aleación de metal fundido
(antimonio, bismuto o estaño). Algunos metales permiten ser reávidos de la punta para formar una
interrupción de 20 a 50 μm de profundidad.
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La punta se sumergen en solución de Platino asta llenar la interrupción, luego se sumerge en agua
destilada. Se puede introducir una membrana hidroponica en la interrupción, y luego se deja secar.
Microelectrodos secos pueden ser almacenados indefinidamente, pero a la membrana se le debe dejar
rehidratarse en agua salina o destilada. Las dimensiones son tipicamente < 2μm. Las corrientes en la
interrupción son de 10-11 amp para microelectrdos de CO2.
5.1.12 Microelectrodos de Doble Barril. Un microelectrodo de doble barril fue diseñado en 1977, con un
grabado de Pt sellado cableado con cera en el barril, se muestra en figura 5.2c. El segundo barril fue llenado
con sal fisiológica. Ejemplo para mediciones de PO2 y actividad bioeléctrica en el cerebro y en la retina de
las abejas utilizando los microelectrodos descritos. La aleación de metal Whalen-Nair llenado,
microelectrodo de cátodo interrumpido de PO2 han sido fabricados en configuración de doble barrido, como
se muestra en figura 5.2d. En 1987 se utilizaron los microelectrodos de doble barril de PO2 y los potenciales
electrofisiológicos en el ojo del gato. En este electrodo en un barril le coloca un cable hecho por un metal
fundido en un tubo de teflón. Combinando los diámetros de la punta, se pueden hacer de menos de 5μm.
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5.1.13 Microelectrodos de Fibra de Carbon. Recientemente, fibras de carbón (7 o 12 μm de diámetro) han
sido utilizadas para construir microelectrodos para medir neurotransmisores y sus metabolismo in vivo. La
fibra de carbón es colocada en una micropepita de vidrio, reparando la fibra en la punta por lacre en la parte
baja del tallo con epoxy u otra sustancia adhesiva conveniente. El contacto eléctrico con la fibra de carbón se
hace por llenar la parte trasera de la parte superior del cuerpo de electrodo con mercurio, con pasta de carbón,
o con una solución de electrolito En la parte alta del cuerpo del electrodo con mercurio, pasta de carbón o
solución electrolítica. Pintura de plata conductiva (Ag/AgCl), es otra técnica común para realizar la conexión
eléctrica en la fibra de carbón. Se pueden utilizar para detectar neurotransmisores, alta reactividad en la
oxidación
5.1.14 Superficies de carbón modificadas químicamente. En 1987 Coury reviso los métodos para
modificar químicamente la superficie en microelectrodos de fibras de carbón. Métodos electromecánicos
han sido utilizados para deliberar cambios en la composición de los óxidos de carbón en la superficie del
electrodo. Electrodos que han sido pretratados por alternancia entre voltaje periódico y directo realzan su
sensitividad a la dopamina. En 1989, se utilizo Nafion un polímetro de DuPont para recubrir los
miroelectrodos de fibra de carbon. Nafion crea una membrana que tiene una gran diferencia de
permeabilidad entre las carga oinicas. Investigadores han reportado que pretratar electromecánicamente o
revestir los electrodos con Nafion han tenido reducción en la sensitividad después de haber sido utilizados
para estudios del cerebro.
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5.1.15 Superficies de carbón modificadas por calor y electricidad. Una técnica común para mejorar los
microelectrodos de fibras de carbón es pasar una corriente a través de la punta. En 1992, se describieron
diferencias en mejoras electromecánicas de fibras de carbón después de tratamiento de calor en vació y
eléctrico. Se tomo 3000 fibras individuales se les dio tratamiento de calor y luego, y se les paso una
corriente de 3000 mA en un buffer de fosfato. Con esto se generaron fracturas y se incremento la
capacitancia en 1000. Después con pruebas de dopamina se vieron mejoras. En 1992 se encontró que las
superficies de carbón pueden endurecer al remover el anódico producido por las superficies fracturadas. El
tratamiento de calor en vació, puede ser utilizado para remover irregularidades en la superficie de las fibras
de carbón.
5.1.16 Superficies de carbón modificadas por Láser. En 1991, se encontró que los microelectrodos de
fibras de carbón mejoraron propiedades de transferencia de carga después de pulsar la punta con un láser de
nitrógeno. La energía del láser vaporizado y oxido la superficie y se puede exponer en sitios mas reactivos.
Los microelectrodos de fibra de carbón se trataron de la misma manera para reducir la dopamina en
potenciales bajos, y el inverso del cíclico busca la onda que se encontró para ser menos dependiente en el PH.
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5.1.17 Requerimientos de Medición. Electrometros de alta impedancia y circuitos de protección son
necesarios. Capacitores de retroalimentación positiva pueden ser utilizados para reducción de capacitancia en
algunos tipos de microelectrodos. Muchas propiedades eléctricas cambian en el microelectrodo si se le coloca
a gran profundidad de un liquido. Otros problemas son el ruido electromagnético y la vibración.
5.1.18 Protección Eléctrica. Técnicas para el mejoramiento de la protección eléctrica incluyen los
alrededores físicos del microelecrodo de referencia. Microelectrodos han sido recubierto con pintura de
plata, o deposición de vapor de metal. En 1982 se descubrió dos técnicas para protección de micropepitas
de vidrio.
Uno fue cubrir un microelectrodo con plata y aislarlo con un polimero, generando una alta carga
capacitancia entre el microelectrodo y la protección. Otro diseño fue un microelectrodo doble concéntrico
con el microelectrodo central revestido del externo. El externo revestido por polystirol para sellar, los dos
se colocan juntos y las puntas se aíslan. Esto redujo la carga capacitiva
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5.1.19 Mediciones clínicas con Microelectrodos. Hay algunas aplicaciones clínicas limitadas utilizando
microelectrodos de metal grabado para mediciones de PO2 en tejidos humanos. En 1990 se realizaron
mediciones de PO2 para tejidos musculares. En 1989, se utilizo un electrodo de polarografia de O2 durante la
cirugía midiendo la tensión acuosa del humor O2 en el ojo humano. En 1977 se midió el PO2 del tejido
cerebral a una profundidad de 2 mm en la corteza humana.
5.2 Microelectrodos modificados con Enzimas
A sido pequeña la investigación en el desarrollo de biosensores modificados de enzimas con
dimensiones de microelectrodos verdaderos. En 1980 se describió brevemente un microbiosensor de glucosa
de un microelectrodo construida de platino-iridio grabado con una punta de 1 μm.
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5.2.1 Co-Deposito de Oxiadasa de Glucosa y Rhodio. En 1992 se co-deposito rodio y oxidasa de glucosa
en microelectrodos de fibra de carbón en un simple paso. Rhodio fue agregado en una solución que contiene
una solución oxiadasa de glucosa. El resultado del material electro depositado en la superficie fue observado
bajo un microscopio de escaneo de electrones y se encontró mucha aspereza. No es recomendado para
insertarlo en tejidos.
5.2.2 Microbiosensores de Glucosa recessed. Un diseño de microbiosensor de glucosa y fibra de carbón
recessed, ha sido diseñado en 1991. Algunos microbiosensores fueron también tratados con glutaraldeidos y
acido ascorbate. El racional para este tratamiento fue por miniaturización posible de interferencia de
ascorbarte desde la siguiente reacción:
Oxiadasa Ascorbate
2l-Ascorbate + O2
2dehydroascorbico + 2H2O
Los microbiosensores de glucosa tienen una perdida de sensitividad inicial de 20% en la primer
hora, luego se estabilizan. El 90% del tiempo de respuesta de estos microbiosensores es menor a 1.5 seg.
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5.2.3 Microbiosensores de Acetilcolina. Microbiosensores para detectar acetilcolina fueron fabricados en
1991, por introducir 125 U esterase y 125 U de oxidase choline en un grabado de fibra de carbón
interrumpido y combinando la enzima con glutaraldeido. La catalización de las enzimas forma las siguientes
reacciones:
Esterase de acetilcolina
Acetilcolina + H2O
acetato + choline
Choline oxidase
Choline + O2
aldeido betain + H2O2
Choline oxidase
Betain aldeido + H2O
betain + H2O2, en presencia de O2
Los microelectrodos fueron tratados con sal orgánica. El 90 % del tiempo de respuesta para este
microbiosensor fue menor a 4 segundos. Los microbiosensores de acetilcolina son sesitivos al ascorbate,
los cuales causan interferencias significativas para mediciones en tejidos donde hay bajos niveles de
acetilcolina.
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Arreglos Miniaturizados
Muchas de las ventajas para microelectrodos pueden ser logradas con arreglos miniaturizados, la
desventaja es que se necesita amplificar las corrientes pequeñas cuando se hacen las mediciones
amperometricas. El efecto beneficial de miniaturizar un transductor electromecanico por formación de un
arreglo de microelectrodos como se ilustra en la figura 5.3
5.3 Con múltiples cátodos hay menor
disturbio del campo de concentración en
un
transductor
electromecánico
comparado con un cátodo simple con la
misma área total.
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5.3.1 Electrodos de O2. Kessler y Grunwald en 1969, desarrollaron un electrodo de O2 de superficie
multialambrada que fue subsecuentemente utilizada en numerosos experimentos de animales. El cátodo
descubierto y el diseño de la membrana recubierta se utilizaron. Las corrientes individuales en los cátodos,
fueron monitoreadas. Los histogramas de distribución de frecuencias se generaron por mediciones de PO2
en tejidos. En 1978, se utilizo un multiarreglo similar de electrodo de superficie de PO2 para medir el PO2
del tejido renal en pacientes con enfermedades en los riñones. En 1980 se desarrollo un multiarreglo de
electrodo de O2 con 10 a 20 vidrios revestidos con cables de oro de 5 a 10 μm sellados con epoxy en una
aguja que puede ser insertada en tejido. En 1984 con agujas similares, se midió el PO2 de los músculos en
voluntarios saludables y pacientes críticos, y se demostró que las infusiones de dopamina puede
incrementar el PO2 en tejidos.
5.3.2 Arreglos de electrodos de O2 transparentes. Sargent y Gough diseñaron 1991 se diseño un arreglo
de electrodo de O2 transparente que consiste en ocho electrodos de trabajo de Pt con diámetros de alrededor
de 100 μm y espaciados 200 μm, aparte con una gran electrodo de referencia común de Ag/AgCl y un gran
contraelectrodo de Platino. Todos los electrodos fueron hechos con semiconductores por métodos de
fotolitografia. Vidrio fue utilizado para soportar la estructura, una delgada capa de polymida recubre el
vidrio y es curado con rayos UV a alta temperatura, entonces el platino farfullea de manera uniforme,
aprox. 370 Amstrong de un metal delgado. Los tranductores electromecanicos, pads y conexiones eléctricas
se realizaron por métodos de fotorresistencias.
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5.3.3 Arreglos de Bandas. Samuelson en 1991 describió un método de Fotolitografia y un método ion beam
etched para fabricar un microarreglo con bandas de ultramicroelectrodos. Utilizan técnicas de patrones de
fotorresistencias para producir bandas de oro de 1 μm de ancho y 200 nm de grueso
5.3.4 Arreglos de Microhuecos. Un arreglo de microhuecos de fibras de carbón interrumpido en epoxy ha
sido fabricado y probado en 1989, el cual se muestra en la figura 5.4.
5.4 Arreglo de microhuecos hecho
de epoxy-carbon con recessed
catodos de fibra de carbon
platinizadas para mediciones O2,
diseñados por Morita y Shimuzu
(1989).
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5.3.5 Arreglos de Microporos. Otro tipo de microarreglo se diseño en 1989, que consistió en llenar de poros
membranas de películas de policarbonato con pasta de carbón. La talla de los poros para diferentes
membranas fueron nominalmente reportadas de 12, 8 y 3 μm por Nucleopore Corp. Con el Microscopio de
electrones se confirmo el diámetro del poro, y determino que la densidad del poro fue 6.4 x 104, 8.8 x 104, y
1.36 x 105 poros/cm2, por cada grado de la membrana.
Agujas Semiconductoras
Ottosensors Corporation hizo una aguja tipo sonda utilizando una película delgada y técnicas de
fabricación de estado sólido que puede tener múltiples transductores, similares a los que se muestra en la
figura 5.5. Estas agujas son comercialmente disponibles con transductores para temperatura, biopotencial y
mediciones de O2. Las señales son amplificadas por medio componentes electrónicos y las sondas se pueden
hacer mediciones en tejido cerebral. Grabaciones de biopotenciales se pueden hacer por electrodos de
Ag/AgCl con áreas pequeñas (10 x 10) μm o grandes (50 x50) μm.
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5.5 Esquemático de la punta de un
lente probado con múltiples sensores
fabricados por Fotolitografia. Señales
para cada sensor pueden ser
amplificados con chips electrónicos
fabricados en el dispositivo, o
procesado después a través de
conexiones asta el fin.
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5.5 Biosensores ENFET
Técnicas de fotoliografia han sido desarrolladas para fabricar Transistores de Efecto de Campo
Ion Sensitivos (ISFET) y Metal Oxido Semiconductor (MOSFET). Estos pueden ser modificados para ser
utilizados como Biosensores basados en enzimas (ENFET)
5.5.1 ISFET. Para las membranas Ion Sensitivas son colocadas sobre el gate y el voltaje se aplica a
través un Ag/AgCl o SCE de referencia en la solución muestra. Como la concentración Ionica varia, el
campo eléctrico en el gate modula la conductancia del semiconductor. El CO2 puede ser sensado por
ISFET utilizando cambios en el pH.
5.5.2 MOSFET. El gate puede ser fabricado con superficie de Metal Oxido como Pt o Pd, el cual sirve
como catalizador por diferentes reacciones. Gases y vapores químicos que pueden ser detectados por el
transductor.
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5.5.3 ENFET. Cada tipo de semiconductor FET puede ser modificado colocando enzimas sobre el
transductor. Un esquemático se muestra en la figura 5.6 donde se utiliza para medir urea utilizando el pH
hecho en 1991. Se deposito una delgada capa de SiO2 en sustrato de zafiro y Fosforo implantado en la
fuente, el drene y una pequeña cantidad en el gate. La sensitividad al pH se mejoro por revestimiento a
1000 μm de Si3N4 en los dos FETs.
Fig. 5.6 Dibujo esquemático de un
biosensor diferencial tipo FET producido
por fotolitografia el cual utiliza
membranas modificadas por enzimas.
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Membranas y Encapsulación
Es imperativo que el dispositivo semiconductor y los cables conectados sean inmersos
en muestras acuosas y que retengan su aislamiento eléctrico de la muestra. Entre 1989 y 1991,
se Eligio zafiro para enlazar el sustrato y se reporto una excelente resistencia en la infiltración de
agua, permitiendo retener aislamiento eléctrico en muestras húmedas por largos periodos.
Nuevas técnicas para atrapar proteinas, anticuerpos y nuevas combinaciones de enzimas son
desarrolladas en diferentes labs.
Fig. 5.7 Dos métodos para aplicar membranas
delgadas en biosensores. Para el método
spincoating, una bruma fino se rocía como el
dispositivo que gira en 1000 a 2000 rpm. Con un
chorro de tinta, los métodos de la automatización
se pueden utilizar para aplicar un volumen
pequeño en una ubicación específica
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REFERENCIAS
[1] Biosensors. Theory and Applications
Donald G. Buerk
[2] Biosensores
Jon Cooper and Tony Cass
[3]Tratado de Fisiologia Medica
Guyton Arthur
http://www.wikipedia.com
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