Transcript pptx - Legeforeningen

Granulocyttfunksjons
undersøkelser
Haakon Sjursen
Universitetet i Bergen/ Haukeland Universitetssjukehus
2013
H.Sjursen
1
Celler i blod
Celle type
Celler/mm3
Erythrocytter
4.8 – 5.4 x 106
Granulocytter
5000 - 9000
Funksjon
Transport av O2 og CO2
(ca 1 per 1000 røde)
Nøytrofile
70%
Fagocytose
Basofile
1%
Histaminproduksjon
Eosinofile
4%
Toksiner mot parasitter
Noe Fagocytose
Monocytter/
Makrofager
5%
Fagocytose
Lymfocytter
20%
B celler: Antistoff produksjon
T celler: Cellemediært immunitet
Plater
300 000
Blod koagulasjon
H.Sjursen
2
Den nøytrofile granulocytt
• Immunforsvarets raskeste
• Produksjon > 1 x 1011 /døgn
• ca. 1500 kg per 80 åring
• Rask turnover: ~ 10 t i blod
• Evt. 1–2 døgn i vev
• Endestadiecelle: effektorcelle
• Cytokinprodusent
H.Sjursen
3
3 linjer i forsvaret mot infeksjon
(Innate immune defence)
H.Sjursen
4
Andre linje forsvar - Fagocytose
Fagocytose Gresk: fago = spise og cyto = celle
– Fagocytose utføres av nøytrofile og monocytter/makrofager
– Nøytrofile dominerer tidlig i infeksjonen
– Makrofager er monocytter som forlater blodbanen og utvikles
til makrofager som vandrer i vev
– Histiocytter er makrofager lokalt i lever, nervesystem, lunger,
lymfeknuter, beinmarg o.a. vev
H.Sjursen
5
Den nøytrofile granulocytt
• Marginasjon
– «Rolling» langs endotelveggen
• Adhesjon
• Migrasjon
• Diapedese (emigrasjon)
• Kjemotakse
• Fagocytose
• Intracellulært drap
• NB: kan ha nedsatt funksjon tross normale granulocytter:
• Ved antistoffmangel eller komplementmangel
H.Sjursen
6
Marginasjon - Adhesjon - Migrasjon - Diapedese
H.Sjursen
7
A neutrophil adheres to the endothelium in a venule (1). It extends its pseudopodium
between the endothelial cells and migrates towards the basement membrane (2).
After the neutrophil has crossed into the tissue, the endothelium reseals behind (3).
The entire process is referred to as diapedesis. (Courtesy of Dr I Jovis)
H.Sjursen
8
Kjemotakse: Fagocyttene trekkes til Infeksjonsfokus
H.Sjursen
9
Klassisk og alternativ komplement pathways trigger
spalting av C3
H.Sjursen
10
Membran Attack Complex (MAC) forårsaker cytolyse
H.Sjursen
11
H.Sjursen
12
H.Sjursen
13
H.Sjursen
14
Reseptorer og signal interaksjoner ved fagocytose av mikrober
(Underhill DM, Ozinsky A, Annu Rev Immunol 2002, 20, 825
Mange
reseptorer er
involvert.
Svikt i én
reseptorgruppe
kan delvis
kompenseres om
andre reseptorer
er normale
H.Sjursen
15
Stadier i fagocytose -1
1.
Adheranse: Fagocyttens plasmamembran
fester seg til bakterien
o
o
o
Hemmes av kapsel (pneumokokker) og M
protein (GAS)
Opsonisering: Coating prosess med
opsoniner som letter feste
Opsoniner: Antistoff og komplement
2.
Internalisering: Plasmamembranen på
fagocytten danner pseudopoder som omgir
mikroben
3.
Mikroben omsluttes av en sekk kalt fagosom
4.
Intraacellulært drap: Fagosomet fusjonerer
med lysosomet og danner fagolysosomet
H.Sjursen
16
Phagocytose
H.Sjursen
17
Stadier i fagocytose -2
5. Lysosomale enzymer dreper bakterien innen 10 sec – 20 min.
– O2 uavhengig
•
Lysozym: Ødelegger peptidoglykan i bakteriens cellevegg
•
Lipaser
•
Lactoferrin
•
Proteaser
•
RNAser og DNAser
6. Etter nedbryting dannes residual legemet med ufordøyelig
materialer som blir utskilt fra cellen
H.Sjursen
18
Oxidativ burst
O2 - avhengig
a) Myeloperoxidase (MPO)
b) MPO- uavhengig
1. H2O2
2. Superoxid anion O2¯
3. Hydroxyl radikal OH ¯
4. Singlet oxygen O2*
5. Ascorbat-peroxid-metall ion
6. Aminosyre oksidasjon
2O2 + NADPH
2O2¯ + 2H+
2O2¯ + H+ + NADP +
H2O2 + O2
H.Sjursen
19
H.Sjursen
20
Elektronmikroskopi av en granulocytt som har internalisert
Staphylococcus aureus (S)
H.Sjursen
21
Intracellulær lokalisering av bakterier
Fusjon
3
1
B
4
2
B
Listeria
B
pH=7.4
Fagosom
B
Lysosom
B
Chlamydiae
Legionella
Mycoplasma
Ingen fusjon med
lysosomet
Cytoplasma
Fagolysosom
S.aureaus
B
Brucella
Salmonella
Coxiella burneti
pH=5.0
Intracellulær lokalisering av antibiotika
Cytoplasma Fagolysosom
volum 1 to 5% av cellevolumet
Fagosom
pH=5.0
pH=7.2
Fluoroquinoloner (x2-8)
beta-lactamer (x0.2-0.6)
Rifampicin (x2)
Aminoglycosides (slow)
Macrolider (x10-50)
Aminoglycosider (x2-4)
Tetracykliner
Fluoroquinoloner
Intracellulær antibiotika aktivitet
Cytoplasma PH 7.2
Fagosom pH 7.2
Fluoroquinoloner
beta-lactamer*
Rifampicin
Aminoglycosider
Macrolider
God
Chlamydia
Legionella
Mycoplasma
Listeria
Fagolysosom pH 5.0
Macrolider
Aminoglycosider
Lav eller 0
Fluoroquinoloner,
Doxycyclin
God
S aureus
Brucella
Salmonella
Coxiella
* Husk:Mycoplasma, Chlamydia, Legionella har ikke cellevegg: β-lactamer virker ikke!
Fagocyttfunksjons undersøkelser
• Måles ved Fagocytose laboratoriet ved Institutt for Indremedisin,
Universitetet i Bergen
• Nasjonal referanse laboratorium
• Hva måles:
– Kjemotakse
– Fagocytose
– Intracellulært drap
– Reseptor ekspressjon: Fc- , komplement reseptorer o.a.
• Hvorfor: Fordi det finnes medfødte og erværvede defekter i alle
disse funksjonene
H.Sjursen
25
Kjemotakse defekter
• Normalt: →1.8 mm/t
• Nedsatt ved:
• Komplement mangel/defekter
Noen infeksjoner
• Inhibitorer (SLE o.a. autoimmune sykdomer
Brannskader
• Cellulær svikt: Chédiak-Higashi syndrom
Malignitet
• Immunglobulinmangel (IgA, IgG 1-4)
Underernæring
• Hyperimmunoglobulinemi E (Job’s syndrom)
Revmatoid arthritt
Diabetes mellitus
• Hypofosfatemi
• Opsonindefekter
• Mannan bindende protein (Lectin) mangel
H.Sjursen
26
Nøytrofile defekter
Defekt i nøytrofil- avhengig immunforsvar
Kvantitativ Nøytropeni – den vanligste
– Ervervet
• Medikament indusert
• Autoimmun
• Cancer
• Leukemi
H.Sjursen
– Hereditær
• Familiær benign
(etnisk) nøytropeni
• Infantil genetisk
agranulocytose
(Severe congenital
neutropenia)
• Cyklisk nøytropeni
27
Kvantitative Granulocyttfunksjons defekter
• Leukemi, aplastisk anemi, nøytropeni, brannskader, sepsis,
diabetes, underernæring, AIDS, nyfødte
• Hyppigere og alvorligere infeksjoner
• Ofte med spesielle mikrober
• Rammer ofte mononukleære fagocytter tilsvarende
• Funksjonsdefekten fører til lite kliniske funn tross fulminant
infeksjon
• Sjelden sepsis og meningitt
H.Sjursen
28
Kvalitative nøytrofile defekter
• Adhesjonsdefekter
– Leukocytt adhesions mangel (LAD)
• Type 1 Integrin mangel
• Type 2 E-selectin ligand mangel
H.Sjursen
29
Defekter i intracellulært srap
• Abnormalt respiratory burst
• Kronisk granulomatøs sykdom
(CGD)
• Glukose-6-fosfat mangel
• Granula abnormaliteter
– Myeloperoxidase mangel
– Spesifikke granula mangler
– Chédiak-Higashi syndrom
H.Sjursen
30
Nøytrofil og lymfocytt fra en pasient med Chediak-Higashi syndrom.
Store dysmorfe granula (se pil)
H.Sjursen
31
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
• 1: 250 – 500 000 (?)
• 70% x-bundet recessiv
• Mutasjoner i gener for 4 plasmamembran proteiner
• Svært nedsatt H2O2produksjon
• Excessiv inflammasjon med granulomer
• DHR-test (Dihydro-rhodamin for intracellulært drap)
H.Sjursen
32
Kronisk granulomatøs sykdom (CGD)
• Alvorlige infeksjoner i hud, øre, lunger, lever, bein
– Gingivitt, aphter
– Infeksjoner med katalase-produserende mikrober:
•
Staphylococcus aureus
•
Bacillus cepacia
•
Aspergillus
Behandling: antibiotika og IFN-γ profylakse
H.Sjursen
33
Behandling av granulocytt defekter
• Antibiotika profylakse
• Granulocytt transfusjon (CGD)
• Beinmargs transplantasjon
• Gen terapi (CGD)
• Stamcelle transplantasjon
– CD34
H.Sjursen
34
Granulocyttfunksjonsundersøkelser
• Kjemotakse
• Fagocytose (og drap)
• Oxidative burst (DHR-test)
• Reseptorundersøkelser
•
Fc-reseptorer (CD16, 32, 64)
•
C-reseptorer (CD11/CD18, CD35)
•
IFNγR1
•
Toll-like reseptorer (2 og 4)
H.Sjursen
35
Kjemotakse
H.Sjursen
36
Transwell kjemotaksi plate
Granulocytter: porestr. 3 µm
Monocytter: porestr. 5 µm
H.Sjursen
37
96 brønners celle cultur plate i
polypropylen m rund bunn til
flowcytometer
ELISA plate Incubator/ Shaker (Labsystems i EMS) til
kjemotaksi, fagocytose, ic. drap
H.Sjursen
38
Flowcytometer (Cytomics FC 500 MPL (Multi-plate loader)
• Væskestrømscytometri
• Fagocytose og oxidativ burst
• S. aureus og opsonisert zymosan
• Fc- og Komplement reseptormåling
H.Sjursen
39
H.Sjursen
40
Fluorescence Assisted Cell Sorting (FACS)
H.Sjursen
41
Med to
lasere
H.Sjursen
42
Med 3 lasere
Med 3 lasere
Gir 5 farger
Med
Med33lasere
lasere
5 Color FACSort optical layout
H.Sjursen
43
FCM sorting av 3 ulike alger
H.Sjursen
44
Flow cytometer output of BacLight® stained marine bacteria. BacLight® is a dual
nucleic acid stain that causes live bacteria to fluoresce green and dead bacteria to
fluoresce red when excited with the 488 nm argon laser of the flow cytometer
H.Sjursen
45
Ly
Celledebris
RBC
Granulocytter
Mo
H.Sjursen
46
gran
Ly
Mo
H.Sjursen
47
Flowcytogram for Oxidativ burst
Samme prinsipp for fagocytose og receptormåling med flere fluoriserende farger
H.Sjursen
48
OXIDATIVT BURST – INTRACELLULÆRT DRAP
OX.BURST
S.aureus S.aureus S.aureus ZYM
SERUM:
Granulocyt
ter
UTEN
%
PHS
PHS
Med Fl1 Med Fl1 Med Fl1
% av
KTR
PHS
ZYM
ZYM
ZYM
ZYM
ZYM
PHS
KTR
KTR
PAS
PAS
Med
Med
Med
Fl1 Med Fl1 Med Fl1 Fl1 Med Fl1 Fl1
% av
% av
% av
KTR
KTR
KTR
KTR
100,0
0,4
62,6
100,0
117,5
100,0
112,0
100,0
116,5
100,0
PAS 1
100,0
0,4
1,8
2,9
7,6
6,5
5,7
5,1
8,7
7,5
H.Sjursen
49
Fagocytose av Staph.aureus-RGX
Oksidativ burst av Staph.aureus
7,0
6,0
5,0
KTR-GRAN
PAS-GRAN
4,0
3,0
2,0
1,0
Oksidativ burst (fluorescence)
Fagocytose (fluorescence)
8,0
35,0
30,0
25,0
20,0
KTR-GRAN
PAS-GRAN
15,0
10,0
5,0
0,0
0,0
PHS
KTR
PHS
PAS
Opsoniserende serum
KTR
Opsoniserende serum
H.Sjursen
50
Reseptor undersøkelser
Merkes med:
– isoktr-FITC
– isoktr-PE: Phycoerythrin
– isoktr-PC5: Phycoeryhrin – Cyanin 5
CD11b-PE:
CD18-FITC:
CD35-FITC:
CD16-PC5:
CD32-PE:
CD64-FITC:
C-receptor III
C-receptor I
Fc-receptor III
Fc-receptor II
Fc-receptor I
H.Sjursen
51
Leukocytt adhesjonsdefekt (LAD)
• LAD1: CD18-defekt, CR3 (komplement reseptor III mangel)
• LAD2: CD15 selectin-mangel
• Nøytrofili
• Defekt adheranse, aggregering, kjemotakse og fagocytose
• Redusert inflammasjon tross fulminant infeksjon (rtg. thorax neg.)
• Infeksjoner i hud/mucosa, gingivitt/periodontitt
• S. aureus og gramnegative stavbakterier
• Prognose relatert til reseptor nivå
H.Sjursen
52
LAD hos pasient, arvet fra mor
*
*CD64, FcR I kompensatorisk økning
Naess A, Sjursen H, Leegaard J: Leukocyte adhesion deficiency in a Norwegian boy. Scand J
H.Sjursen
53
Infect Dis; 1999;31(6):600-2
H.Sjursen
54
Rekvirering av analyser
• Undersøkelsene gjøres ved:
Infeksjonsmedisinsk forskningslaboratorium, Klinisk Institutt 2,
Det medisinsk-odontologiske fakultet, Universitetet i Bergen
• Forhåndsavtale nødvendig:
• Kontakt Overingeniør Steinar Sørnes Tlf. 55973067
• eller
Haakon Sjursen Tlf. 55972924
Takk for oppmerksomheten!
H.Sjursen
55