Transcript control de la biocontaminación en ambientes clasificados
CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN EN AMBIENTES CLASIFICADOS
Antonio Rodríguez Acosta Facultativo Especialista Análisis Clínicos Responsable de Calidad Unidad de Producción Celular HRU Carlos Haya (Málaga) COLABORADOR ASESORÍA TÉCNICA GRADOCELL
1. Iniciativa Andaluza de Terapias Avanzadas 2. Plan general de control ambiental 3.
Métodos de muestreo
Impulsar el desarrollo y la traslación clínica de nuevas terapias basadas en los resultados de los 3 programas de investigación relacionados con las terapias avanzadas
PROGRAMA ANDALUZ DE
TERAPIA CELULAR Y MEDICINA REGENERATIVA
PROGRAMA ANDALUZ DE
GENÉTICA CLÍNICA Y MEDICINA GENÓMICA
PROGRAMA ANDALUZ DE
NANOMEDICINA
Laboratorios GMP Públicos de Terapia Celular en ANDALUCÍA
UBICADOS EN CENTROS DE INVESTIGACIÓN:
CABIMER: acreditado.
LABORATORIO ANDALUZ DE REPROGRAMACIÓN CELULAR: en validación.
UBICADOS EN HOSPITALES:
Hospital Virgen de las Nieves: acreditado.
Hospital Reina Sofía: acreditado.
Hospital Carlos Haya : en validación.
UBICADOS EN BANCOS DE TEJIDOS:
Banco de Tejidos de Málaga: acreditado.
Banco de Tejidos de Granada: en validación.
Banco de Tejidos de Sevilla: en validación.
Banco de Tejidos de Córdoba: en validación.
Plan General de Control Ambiental
5
CONTROL DE LA BIOCONTAMINACIÓN Plan general de actuación
• Medicamentos usados en terapia celular:
“fabricación aséptica” (media fill):
– carga microbiana del ambiente de fabricación: clave para garantizar la esterilidad de los productos fabricados.
•
Biocontaminación:
contaminación de materiales, equipos, superficies, líquidos y gases con partículas viables.
• Control de la biocontaminación: – establecer
principios y metodología
contaminación microbiológica.
para controlar los niveles de – definir las
medidas de control
adecuadas para
disminuir el riesgo
de contaminación.
6
Plan general de actuación Principales vías de entrada de microorganismos a las instalaciones:
– Personal: • Partículas generadas por la descamación de la piel: – personal de producción/control de calidad; – operarios de mantenimiento de instalaciones; – personal implicado en la cualificación de equipos; – operarios de limpieza.
• Comportamiento en el área clasificada – Materiales: • introducción de materiales y reactivos; • introducción de equipos/instrumentos;
FORMACIÓN
• actuaciones de mantenimiento en la instalación (sustitución de elementos).
7
Plan general de actuación Procedimientos que pueden afectar al nivel de biocontaminación
– entrada de personal y vestuario; – introducción de materiales; – limpieza y desinfección de instalaciones y equipos; – métodos de control microbiológico del área clasificada.
8
Principios generales Control microbiológico
–
identificación de riesgos
para el producto; –
probabilidad
de que éstos ocurran; – medidas de
prevención y control
; – designación de las
zonas de riesgo
,
procedimientos de muestreo
; determinación de los
puntos
y – establecimiento de
límites
que aseguren el control microbiológico
(niveles de alerta y acción
); –
medidas correctoras
a realizar cuando se superen los niveles de alerta y acción.
9
Principios generales.
Durante la puesta a punto de la instalación (condición
“en reposo”
) se establecerá un
NIVEL BASAL DE CONTAMINACIÓN
que posteriormente ha de ser monitorizado
“en funcionamiento”
contaminación.
con el fin de detectar aumentos en los niveles de Niveles de alerta y acción –
Nivel de “alerta”
: – • ESTABLECIDO POR EL USUARIO; • proporciona una normales;
alarma temprana
ante el desvío de las condiciones • implica un
aumento de la atención
sobre el proceso.
Nivel de “acción”:
• (ESTABLECIDO POR EL USUARIO); • requiere intervención inmediata; • investigación de la causa; • establecimiento de medidas correctoras.
10
Metodología general control microbiológico
• •
Muestreo
,
incubación, recuento e identificación si procede
partículas viables mediante: de – métodos adecuados; – plan de muestreo preestablecido
(puntos y frecuencia).
Minimizar el riesgo de contaminación
debido a los propios métodos de muestreo.
• Preferible muestrear con la instalación
“en funcionamiento”
personal realizando operaciones habituales).
(equipos y • No debe comprometerse de ninguna manera las operaciones de fabricación ni poner en riesgo la calidad del producto.
• Las condiciones de muestreo (ej: número de operarios en la zona) deben quedar registradas o trazadas.
11
Frecuencia de muestreo
• Ha de estar previamente establecida (ej: semanal y mensual) y revisarse según sea necesario en los siguientes casos: – superación reiterada de los niveles de alerta o de acción; – paradas prolongadas de las instalaciones; – realización de trabajos de mantenimiento de ventilación;
importantes
en los sistemas – obtención de resultados inusuales; – cambios en los procedimientos de limpieza o desinfección; – acontecimientos biocontaminación.
inesperados que puedan favorecer la 12
Identificación de las muestras
• Mantener la trazabilidad con la siguiente información: – punto de muestreo; – fecha y hora; – personal que realiza el muestreo; – actividad realizada en la sala durante el muestreo; – lote y medio de cultivo usado; – equipos utilizados para el muestreo e incubación; – desviaciones sobre el plan de muestreo.
13
Procesamiento de muestras. Medios de cultivo.
• Medios de cultivo • Condiciones de incubación según microorganismos esperados .
•
No selectivos:
– capaces de soportar el crecimiento de una amplia variedad de microorganismos; – medios con base tripticasa de soja son ampliamente aceptados (TSA y TSB).
•
Garantizar la calidad
de los medios empleados: – especificaciones; – certificados de análisis.
•
Demostrar
crecimiento cada Unidad: según condiciones de incubación establecidas en – ensayos de promoción de crecimiento.
14
Procesamiento de muestras. Condiciones de incubación.
– 2-5 días (30-35 ºC) bacterias; – 5-7 días (20-25 ºC) hongos y levaduras Generalmente aceptados cuando el número de partículas viables es pequeño.
–
Otras condiciones de incubación:
siempre y cuando se
demuestre que proporcionan el ambiente adecuado
microorganismos presentes en la instalación.
para promover el crecimiento de los – Sospecha microorganismos con
necesidades exigentes
medios de cultivo, períodos y condiciones de incubación adecuados.
de crecimiento: –
Control de estufas:
las condiciones de incubación han estar monitorizadas.
– Observación
periódica de las placas
durante la incubación.
15
Recuento e Identificación de microorganismos aislados
• El nivel de
caracterización
dependerá de la criticidad del área clasificada: – morfología celular mediante tinción de Gram (ej, áreas no críticas); – identificación a nivel de género y especie (áreas críticas).
• Los identificaciones obtenidas pueden ayudar a: – –
evaluar procesos
resistencias); de limpieza y desinfección implantados (aparición de
identificar
las posibles
fuentes
de contaminación.
• Si los resultados indican: – –
superación de los límites
establecidos;
cambio en el estatus
microbiológico de la instalación.
ACCIONES CORRECTIVAS
16
Métodos de control microbiológico
17
Métodos de control microbiológico
• Niveles de control : – aire: •
muestreo pasivo:
sedimentación de partículas viables; •
muestreo activo:
volumétrico de aire por impacto de partículas viables en medios sólidos ; – superficies; – (vestimenta); – (líquidos).
18
Sedimentación de partículas viables.
• Microorganismos en ambiente:
transportados por
tamaños provenientes principalmente de:
partículas
de diferentes » descamación de piel humana; » aerosoles (saliva) ; » polvo.
• El tamaño de partícula determina la velocidad de sedimentación (media 0.46 cm/s, puede variar entre 0.2 y 3 cm/s* ) • Medida de la sedimentación de partículas viables sobre las superficies
Valoración directa de la probabilidad de contaminación del producto
.
*W. Whyte and NDS Bell, “The prediction of airborne contamination of aseptically filled containers: a case study” 19
Sedimentación de partículas viables.
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF): • Placas de 90 mm de diámetro (64 cm 2 ).
GRADO A B C D Ufc /placa de 90 mm diámetro.
< 1
5
50 100 •
Deshidratación del medio
por exposición al ambiente: reducción en la viabilidad de los microorganismos (máxima exposición 4 horas).
• La contaminación del producto mediante partículas viables presentes en el ambiente es
directamente proporcional
a: – área de la “boca” de los contenedores (ej, flask de cultivo); – tiempo en que los contenedores están abiertos (tiempo de exposición); – calidad microbiológica del aire.
20
Sedimentación de partículas viables.
• Relacionando el
área
y
tiempo de
sedimentación se puede calcular la
exposición
del producto y placas de probabilidad de contaminación del producto: 21
Sedimentación de partículas viables .
• Ventajas: – económico; – monitorización de procesos: pueden colocarse muy próximas al área donde el producto está expuesto; – no interfiere con el flujo de aire de la zona (monitorización en CFL, grado A); – riesgo bajo para la calidad del producto y la esterilidad del proceso; – no es necesaria la participación de personal adicional.
• Inconvenientes: – Debido a los bajos niveles de contaminación esperados, presenta poca sensibilidad, a menos que los períodos de muestreo sean amplios.
22
Muestreo volumétrico de aire
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF):
GRADO A B C D Ufc permitidas/m 3
< 1 10 100 200 • Recolección de partículas viables mediante un
apropiado
y de acuerdo con un
plan de muestreo
.
instrumento de muestreo
• Estimación de la cantidad de microorganismos tanto nos proporciona una
medida indirecta
del
suspendidos en el aire riesgo de
y por
contaminación del producto.
•
Muestreador de aire:
aspira e impacta (a velocidad de 11 m/s) todas las partículas de tamaño superior a 1 μm sobre una superficie de agar nutritivo (también en medios líquidos).
23
Muestreo volumétrico de aire
• Volumen a muestrear:
1 m 3
.
• Tamaño recomendado de las placas usadas: 90 mm de diámetro (64 cm 2 ).
•
Corrección estadística de FELLER
: a mayor cantidad de microorganismos, mayor probabilidad de que penetren varios microorganismos por el mismo orificio de la tapa y se solapen las
ufc
que aparecen tras incubación.
• Muestrear desde las zonas de
mayor a las de menor grado.
•
Aseptizar/esterilizar el cabezal
antes de una jornada de muestreo.
24
Control microbiológico de superficies
• Límites de aceptación (Anexo I, NCF):
GRADO A B C D Ufc /placa 55 mm
< 1 5 25 50 • • Objetivo: determinar la
eficacia de los procedimientos de limpieza
rutinarios
Fuentes de contaminación
de superficies: – sedimentación de partículas viables.
– contacto directo con el operador.
• Los medios usados han de poseer
agentes neutralizantes
que inactiven los residuos de los productos de limpieza usados:
Desinfectante
Fenólicos Clorados Iodados Compuestos de amonio cuaternario Peróxido de hidrógeno
Neutralizante
Polisorbato 80 (Tween 80) Tiosulfato sódico Tiosulfato sódico Lecitina + Tween 80 Piruvato sódico, catalasa 25
Control microbiológico de superficies
• • • •
Muestreo con placas de contacto
Se aplica un medio nutritivo
sólido
sobre una superficie de área conocida.
Placas de 55 mm de diámetro (25 cm 2 ) tipo RODAC (Replicate Organisms Detection And Counting).
• Las
ufc
obtenidas son una área analizada.
imagen
de los microorganismos presentes en el El medio nutritivo ha de estar en contacto con la superficie durante unos segundos, ejerciendo una presión uniforme en toda la placa y en ausencia de movimientos.
Limpiar cuidadosamente con
estéril
el
solución desinfectante (alcohol 70%) y toallita
área muestreada con el fin de eliminar los restos de medio de cultivo.
26
Control microbiológico de superficies Muestreo con hisopos
• Hisopos
previamente humedecidos:
inaccesibles a las placas de contacto.
muestreo de zonas irregulares o • Se han de realizar
trazadas paralelas
analizar. Posteriormente se repite la por la superficie que se desea operación en el mismo área y con el mismo hisopo pero con trazadas
perpendiculares a las anteriores
. El hisopo al mismo tiempo ha de rotarse.
• Posteriormente el hisopo se introduce una siembra e
en medio líquido y agita.
Se realiza incubación de este medio líquido en placas de medio sólido.
27
Principales fuentes de biocontaminación Microorganismo
Cocos gram + (Micrococos) Staphylococcus Bacillus Hongos filamentosos Levaduras
Estado
Formas vegetativas.
Formas vegetativas.
Formas vegetativas.
Esporas
Formas vegetativas.
Esporas
Formas vegetativas.
Principales fuentes de contaminación
Partículas de descamación de la piel y aerosoles (tos).
Pelo, piel, heridas, abscesos, ropa y polvo.
Aire, ropa.
polvo, cartón, papel
, agua y Suelo,
polvo, cartón y papel.
Pelo y piel.
28
Conclusiones
• La función principal de la monitorización microbiológica es
tendencias
que sugieran una
pérdida del control ambiental.
identificar
• Medidas para contener la contaminación: – Entrenamiento y
formación
del personal.
– Evitar acceso de personal no autorizado.
– Mantener en
adecuado estado las instalaciones
humedad, presiones).
(filtros, temperatura, – Correctas medidas de
desinfección de materiales
.
– Adecuado sistema de
entrada y vestimenta
del personal.
–
Eficaz sistema de limpieza
(personal entrenado y desinfectantes adecuados).
29
Bibliografía
• • ISO 14644: Cleanrooms and controlled environments: – – Part 1:Classsification of air cleanliness Part 2: Specifications for testing and monitoring ISO 14648: Cleanrooms and associated controlled environments. Biocontaminacion control: – – Part 1: General principles and methods.
Part 2: Evaluation and interpretation of biocontamination data.
• Guidelines on test methods for environmental monitoring for aseptic dispensing facilities. Second edition.
• Garcia, Lynne S. (2010). Clinical Microbiology Procedures Handbook, Volumes 1-3 (3rd Edition). American Society for Microbiology (ASM).
• • ( http://www.knovel.com/web/portal/browse/display?_EXT_KNOVEL_DISPLAY_bookid=4194&VerticalID=0 ) WHYTE, W. In support of settle plates. PDA Journal of Pharmaceutical Science and Technology, 50, pp. 201-204, 1996 Evaluation of Irradiated Count-Tact 3P Performances bioMérieux Industry Culture Media Group, Chemin de l’Orme, 69280 Marcy l’Etoile, France.
30