2011-2012

Biotechnologies végétales

Marie Françoise Niogret Maria Manzanares Antoine Gravot

UMR 118 Amélioration des Plantes et Biotechnologies Végétales – INRA Agrocampus Ouest Université de Rennes 1

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Biotechnologie : Définition OCDE (2005)

 L’application de la science et de la technologie à des organismes vivants, de même qu’à ses composantes, produits et modélisations, pour modifier des matériaux vivants ou non-vivants aux fins de la production de connaissances, de biens et de services. ? Mais comment en est on arrivé à des définitions aussi sibyllines ?

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Biotechnologies «

l’application des principes scientifiques et de l'ingénierie à la transformation de matériaux par des agents biologiques pour produire des biens et services » (OCDE)



technologies de bioconversion

Fermenteurs Bioréacteurs

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Biotechnologies végétales

« Développement et utilisation de techniques de cultures in vitro dans différents domaines relatifs au végétal et à l’amélioration variétale»

  Haplodiploïdisation Culture de méristèmes   Micropropagation Sauvetage d’embryons   Fusion de protoplastes Création de variabilité   Banque de germoplasmes … www.srpv-bretagne.com

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Biotechnologies « Technologies impliquant l’obtention et/ou l’utilisation d’organismes génétiquement modifiés »

“Biotechnologies modernes” (Protocole de Carthagène)

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Biotechnologies

« Développement et application d’outils moléculaires dans différents domaines relatifs à l’agronomie et la médecine »

•Science Museum/Science & Society Picture Library

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Biotechnologies

« Technologies innovantes basées sur des connaissances scientifiques dans le domaine du vivant, impliquant d’importants investissements en R&D et une large ambition commerciale» Meristem Therapeutics Bretagne Biotechnologies Végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales 

Définitions

Issues du génie des procédés (« école allemande ») – Définition historique (Karl Ereky), début XXème –  Technologies de la biotransformation Mots clés : génie des procédés, production industrielle  Issues du génie génétique (« école américaine ») – – Depuis les années 70  « Utilisation des techniques de l’ADN recombinant » Mots clés : ADN recombinant, protéines hétérologues, organismes génétiquement modifiés  Notion de « Biotechnologie moderne » du Protocole de Carthagène  Plaçant au premier plan l’ampleur des investissements R&D et des débouchés industriels et commerciaux  Définitions concernant spécifiquement le végétal et les techniques de culture

in vitro

 Plus récemment : définitions incluant les approches de génomique

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Definition proposée par l’Association Française des Biotechnologies Végétales : Les biotechnologies végétales sont des technologies qui recouvrent toutes les interventions en laboratoire sur les organes, les tissus, les cellules ou l’ADN des végétaux, soit pour mieux maîtriser ou accélérer leur production, soit pour améliorer leurs caractéristiques, au service de la recherche, de l’agriculture ou de productions industrielles.

Et une définition plus simple que je vous propose: Ensemble de pratiques faisant appel aux cultures

in vitro

de plantes et aux techniques de biologie moléculaire dans les domaines de l’agronomie, l’industrie et la recherche fondamentale

S7 : Technologie et biotechnologie végétales  Cours – – – – Cultures in vitro Marqueurs moléculaires Transgénèse Applications non-alimentaires A. Gravot M.Manzanares

M-F.Niogret

A.Gravot

  TD/contrôle continu – Analyse d’articles par binômes  Synthèse écrite 500 mots pour le lundi 3 octobre + diaporama  Conseils personnalisés pour améliorer le diaporama le 7 octobre –  12 et 13 octobre: soutenances orales : 12 minutes T DNA & données de transcriptome (par binôme)   2 TD en salle bioinformatique Rapport à remettre pour le 6 décembre TP en septembre – B-A BA de la manipulation d’explants et de la préparation de milieux de culture. – Préparation et utilisation de protoplastes  Visite de l’IGEPP (INRA Le Rheu): Haplodiploïdisation & transgénèse Colza + Plateau de génotypage

1.

Recombinaison homologue chez les végétaux Zinc Finger Proteins

&

TALEN

: S7 : Technologie et biotechnologie végétales volume 29 number 8, Shaked et al. 2005 PNAS, Hanin 2001 et 2003, Reiss1996

2.

Alternatives à l’utilisation de gènes de résistance à des antibiotiques :

Golstein et al. 2005, Scutt 2002, Iamtham 2000, Scheid, 2005 3.

4.

Transformation des génomes chloroplastiques

PNAS, Daniell 1998, Daniell 2002 NatBiotec Ruf 2007 PNAS, Daniell 2007

Transgénèse et métabolisation du glufosinate

Dröge et al. Planta 1992, 187:142 151, Metz et al. Molecular Breeding 4: 335–341, 1998. 5.

ARN interférent :

a.

mécanismes applications

: Fusaro et al. 2006 EMBO, Smith et al. 2000 Nature, Schwab 2006, Waterhouse 1998 PNAS, Small 2006, Brodersen 2005, 6.

b.

c.

d.

Metzlaff et al. Cell, Vol. 88, 845–854

Impact du froid sur l’efficacité du RNAi

Szittya 2003 EMBO

Stratégie RNAi pour la résistance aux virus :

Niu et al. 2006 Nat Biotec

Stratégie RNAi pour la résistance aux insectes :

Price&Gatehouse 2008 Trends Genetics, Gordon &Waterhouse Nat Biotec 2007 , Mao et al. 2007 Nat Biotec

Expression de protéines thérapeutiques

: Ma et al. 2003, Stoger et al. 2005, Richter 2000, Tiwari2009 7.

8.

9.

Génie métabolique

: a.

Contenu en vitamine E dans l’huile de soja: b.

synthèse d’alcaloïdes chez le pavot Frick et al. 2007 Metabolic Engineering c.

d.

pro-vitamine A

: le golden rice 2

arômes chez la tomate

Lewinsohn 2001 Plant Physiology

Génie métabolique chez les arbres

: Pilate 2002 Nat Biotec, Hu 1999 Nat Biotec, Editorial NatBiotec2005, Chen&Dixon 2007 Nat Biotec

Tolérance aux stress abiotiques

a.

secondaires : la voie du contrôle du statut oxydatif :

Bartel 2001 b.

Transport membranaire du sodium et tolérance au sel

: Zhang & c.

Blumwald 2001, Apse&Blumwald Science 1999

expression de chaperones hétérologues :

Castiglioni 2008 Plant Physiology 10.

Apomixie

chez le maïs Singh et al. 2011 Plant Cell 29 (8) 11.

L’haploïdisation par des histones modifiées

Copenhaver et Preuss 2010 Nat Biotech 12.

Licences open-source BIOS & travaux de R.A. Jefferson :

Broothaerts et al. 1995 NATURE 433, Chilton 2005 Nature Biotechnology 23(3) 13.

Analyse de la controverse sur la présence de transgènes dans les stocks de semences fermières de maïs au Mexique

Quist 2001, More 2002, Marris 2005, Dyer 2009

Totipotence de la cellule végétale

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation (site du GNIS)

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Gretchen Vogel, 2005

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Historique de la culture de tissus et d’organes de plantes

 Contexte théorique au début du XX ème siècle: – Théorie cellulaire (Schleiden et Schwann) – Comment étudier le comportement de cellules isolées ?

Microbiologie et biochimie Cultures en conditions stériles Caractérisation de substances de croissance

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

G. Haberlandt : le concept de totipotence de la cellule végétale

Deux idées importantes : •la culture de cellules isolées constituerait potentiellement un modèle de recherche •maintien en vie de cellules isolées •Pas de multiplication cellulaire http://users.ugent.be/~pdeberg h/his/his2az1.htm

•on peut potentiellement régénérer une plante entière à partir d’une cellule isolée  totipotence •Échec (mauvais choix d’explants, méconnaissance des substances de croissance)

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Émergence des techniques de culture

– Haberlandt (1902) : concept de totipotence – – – White (1934) : culture

in vitro

de racines de tomates Gautheret (1935) : utilisation d’auxine pour cultiver du cambium de saule 1939 : 1ère culture indéfinie de cals de carotte https://www2.carolina.com

La culture de tissus est possible en utilisant des substances de croissance et/ou des tissus méristématiques

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Émergence des techniques de culture

– Braun (1941) : travaux sur le crown gall Croissance

in vitro

des tumeurs sans ajout d’hormones – Miller (1955) : cytokinines – Murashige et Skoog : mise au point de milieux de culture efficaces contenant des cytokinines et des auxines Organogénèse & callogénèse

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

“La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation”

Sugimoto 2010 Dev Cell Birnbaum 2008 Cell

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Confirmation des hypothèses d’Haberlandt

Aspects historiques  1956 (Muir) suspensions cellulaires  1958 (Reinart et Stewart) Embryogenèse somatique chez la carotte

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Confirmation des hypothèses de Haberlandt

 1960 Production fiable de protoplastes par digestion enzymatique (Cocking)  1971 (Nagata et Takabe) Régénération d’un plant entier à partir d’un protoplaste

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Développements : des outils agronomiques

 1965 (Morel) Germination et micropropagation

in vitro

des orchidées  1967 (JP Bourgin & JP Nitsch) : tabacs haploïdes à partir d’anthères  1973 : hybride issu d’une fusion de protoplastes Aspects historiques

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Développements : production de métabolites secondaires

 1977 : culture de cellules de tabac dans un réacteur de 20 000 litres  1983 (Mitsui Petrochemical) : production industrielle d’un pigment: la shikonine  1997 L’entreprise Samyang Genex (Daejeon, Corée) produit un anticancéreux, le Genexol, à partir de cultures in vitro de

Taxus

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Développements : la transgenèse

 Marc Van Montagu (1983) : tabac résistant à la kanamycine  1994 : Flavr Savr (Calgene, antisensage d’une polygalacturonase)  1996 : maïs transgénique commercialisé aux USA

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Sussex, Plant Cell 2008

S7 : Technologie et biotechnologie végétales Aspects historiques

Conclusions

 Problématique initiale : – – recherche d’un modèle de cellules isolées démonstration de la totipotence des cellules végétales Identification du rôle des substances de croissance Mise au point de nombreuses techniques Transgénèse

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Revenons sur le phénomène de totipotence…

Les cellules végétales, prélevées sur un organe quelconque d'une plante, possèdent la capacité de régénérer un individu complet identique à la plante mère. C'est la totipotence des cellules végétales. Elle repose sur l'aptitude à la dédifférenciation (site du GNIS)

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Embryogenèse / Organogénèse

 Embryogénèse  à partir de cellules somatiques  à partir de cultures de cellules “indifférentiées”  Garces et al. PNAS 2007 Régénération d’organes et de tissus à partir de cellules somatiques ou de cellules « indifférentiées » Birnbaum 2008 Cell Sena & Birnbaum 2010 Birnbaum 2008 Cell

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Des cellules plus ou moins totipotentes

Les méristèmes : •un réservoir de cellules totipotentes Les autres types cellulaires : • une totipotence plus ou moins facile à exprimer Variabilité •Utilisation de substances de croissance exogènes •Régénération directe interspécifique •Régénération en passant par un stade de cal

Principales méthodes de micropropagation

Meristème Apex caulinaire

Culture de méristème

Tige feuillée

Enracinement

Plantules Nœud Morphogenèse directe

Caulogenèse directe Embryogenèse somatique directe

Explants divers (racines, tige, feuilles…) cal Morphogenèse indirecte

Callogenèse

D’après Lindsey et Jones 1989 Suspensions cellulaires Semences artificielles Caulogenèse indirecte

Embryogenèse somatique indirecte

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“La totipotence repose sur l’aptitude à la dédifférenciation” (?)

Sugimoto 2010 Dev Cell Birnbaum 2008 Cell

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Comprendre la nature des cellules souches

 Notion de cellule souche en biologie végétale  Notion de niche de cellule souche en biologie végétale

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Comprendre les mécanismes de dédifférenciation

 Modulation de l’expression génétique via des mécanismes épigénétiques – Reconformation de la chromatine  Modification des histones  Méthylation de l’ADN

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Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle

S7 : Technologie et biotechnologie végétales

Le rôle du péricycle : un grain de sable dans le modèle

S7 : Technologie et biotechnologie végétales CONCLUSION: In this study, we show that callus formation from multiple organs is not a process of reprogramming to an undifferentiated state, but rather the differentiation of pericycle-like cells present in the organ toward root meristem-like tissue. In this case, the pericyle-like cells are functionally analogous to animal tissue stem cells, which are found in many tissues throughout the body and can divide and differentiate into specialized types of cells.

This leaves open the question how root meristem-like callus tissue has the ability to form aerial shoots in the next stage of the regeneration process Kaoru Sugimoto, Yuling Jiao, and Elliot M. Meyerowitz