Transcript terreni di coltura

TERRENI
DI
COLTURA
Una condizione per poter studiare i
microrganismi è poterli coltivare nelle
condizioni di laboratorio
Per questo scopo si devono conoscere
quali sostanze nutritizie e quali
condizioni fisiche essi richiedono
COLTIVAZIONE DEI BATTERI
La coltivazione dei batteri in laboratorio
richiede l’impiego di “terreni di coltura”
con i quali si cerca di riprodurre
artificialmente un ambiente in grado di
soddisfare le esigenze metaboliche del
batterio che si desidera coltivare
I terreni di coltura contengono tutte
quelle sostanze organiche ed inorganiche
necessarie per la crescita del
microrganismo
La composizione chimica dei diversi
terreni di coltura è in parte differente
in relazione alle necessità nutrizionali del
batterio che si desidera coltivare
Alcune sostanze sono necessarie a tutti i microrganismi,
in quantità notevoli: si tratta di quelle che sono
necessarie per le biosintesi, e che entrano quindi a far
parte delle principali componenti strutturali della cellula,
come carboidrati, proteine, lipidi e acidi nucleici Queste
sostanze vengono definite:
“Macronutrienti”
CARBONIO
AZOTO
OSSIGENO
IDROGENO
ZOLFO
FOSFORO
servono per la sintesi
dei componenti
strutturali della cellula
In un secondo gruppo di macronutrienti si trovano gli
elementi usati in quantità relativamente elevate rispetto
agli altri sali. La maggior parte di queste sostanze è
necessaria a tutti i batteri, ma alcune sono fondamentali
soltanto per alcune specie o in particolari momenti
Alcuni elementi sono necessari alla cellula, ma in
quantità molto esigue: generalmente le tracce contenute
in sali o nell’acqua sono sufficienti a garantire la
crescita del microrganismo
Se tuttavia si usano sali e acqua particolarmente puri,
questi elementi devono essere aggiunti ai terreni sotto
forma di soluzioni bilanciate
Queste sostanze vengono definite:
“Micronutrienti”
TRASPORTO DEI NUTRIENTI
ALL’INTERNO DELLA CELLULA
Per poter utilizzare i nutrienti è necessario
portarli all’interno della cellula: l’unico composto
chimico che entra o esce senza difficoltà alcuna
dalla cellula batterica, è l’acqua
TRASPORTO FACILITATO
Alcuni soluti possono passare il filtro della membrana
per diffusione passiva (senza spesa di energia da parte
del microrganismo) questo processo è tuttavia poco
efficiente e troppo lento e i procarioti fanno ricorso a
enzimi di membrana (le permeasi)
TRASPORTO ATTIVO
la concentrazione interna si mantiene superiore
a quella esterna, spendendo energia
L’energia spesa per il trasporto dei nutrienti
può provenire dall’ idrolisi di ATP
I terreni che si usano in
batteriologia devono:
 contenere tutti i nutrienti necessari alla crescita dai
batteri da coltivare
 l’acqua disponibile (Aw) deve essere adeguata (per la
maggior parte dei microrganismi l’ideale è superiore a
0,98) il pH deve essere intorno a 7,2 a meno di richieste
particolari, e il potenziale redox idoneo
Possono essere liquidi (per ottenere biomassa
senza limiti spaziali), o solidi
Per solidificare i terreni si impiega L’AGAR
Un polisaccaride, estratto da alghe, che presenta il
fenomeno della sovrafusione (liquefa a 100°C ma resta
liquefatto fino a 45°C). L’uso dell’agar permette di dare
al terreno la forma voluta, versandolo ancora liquido nel
contenitore più idoneo e lasciandolo solidificare
Inoltre:
 non è metabolizzato dalla gran parte dei
batteri;
 non manifesta alcuna tossicità;
i microrganismi
invisibili ad occhio nudo
(<0,2 mm) si rendono visibili, dopo
replicazione su substrato solido o liquido
Preparazione dei terreni
1. Dissoluzione degli ingredienti in volume
di H2O.
2. Determinazione del pH ed eventuale
correzione.
3. Distribuzione in contenitori idonei.
4. Sterilizzazione
In base alle sostanze che contengono e alle loro
concentrazioni relative, i terreni di coltura sono
classificati come:
 Sintetici (o definiti)
 Complessi
Terreni sintetici o definiti
 I terreni sintetici o definiti sono quelli di cui si
conosce l’esatta composizione. Vengono quasi sempre
preparati ad hoc a seconda delle esigenze nutrizionali
del microrganismo che si desidera far crescere.
 Contengono un numero definito di sostanze a
concentrazione nota.
Terreni complessi
 sono quei terreni di cui non si conosce in maniera
dettagliata la composizione chimica
 Questi mezzi di coltura risultano di estrema utilità in
quanto permettono di far crescere
contemporaneamente specie con esigenze nutrizionali
molto diverse fra loro
 Inoltre è possibile crescere specie le cui esigenze
nutrizionali non sono ancora ben conosciute
Oltre alle sostanze “standard” i terreni complessi contengono:
Peptoni, idrosilati proteici che derivano da una parziale digestione
proteolitica (questi particolari proteine son parzialmente idrolizzate
altrimenti denaturerebbero ad alte temperature);
Estratti di carne magra, ricchi in amminoacidi peptidi, acidi
organici, vitamine e sali minerali;
Estratti di lievito, ricchi di vitamina B e composti del carbonio e
dell’azoto.
I caratteri colturali forniscono indizi
utili per l’identificazione

COLONIE SU AGAR
ACCRESCIMENTO SU AGAR A BECCO DI
CLARINO

ACRESCIMENTO SU BRODO
NUTRITIZIO

ACCRESCIMENTO PER INFISSIONE IN
GELATINA

Caratteristiche visive dell’avvenuto
accrescimento in brodo
Crescita in terreni solidi
(piastre Petri)
Crescita in substrati solidi
(agar becco di clarino)
POPOLAZIONI MICROBICHE NATURALI
La popolazione microbica presente nel nostro ambiente è
grande e complessa. Molte differenti specie microbiche
popolano contemporaneamente vari distretti del nostro
corpo (mucose: orale, intestinale, cutanea) ed in modo
analogo il nostro ambiente (aria, suolo, acqua).
COLTURE MISTE
PER STUDIARE I DIVERSI BATTERI CHE
COLONIZZANO UN HABITAT O PER ISOLARE UN
PATOGENO BISOGNA ISOLARE E COLTIVARE IN
FORMA PURA IL MICRORGANISMO
Una coltura pura è costituita da una
popolazione di cellule derivate tutte
da un’unica cellula madre
Essa rappresenta una condizione
artificiale per l’accrescimento dei
batteri ed è una condizione imposta
da manipolazioni di laboratorio
Classificazione qualitativa dei terreni
Terreni elettivi
Sono terreni ricchi di nutrienti, spesso con la presenza di sangue di
pecora o cavallo, che consentono la crescita di quasi tutte le specie
batteriche di interesse medico.
Terreni selettivi
Sono terreni che favoriscono la crescita solo di particolari specie
batteriche grazie alla presenza di fattori che inibiscono lo sviluppo di
altre specie.
Terreni differenziali
Sono terreni che, grazie alla presenza di particolari componenti,
permettono di distinguere fra diversi gruppi di batteri, consentendo
una identificazione presuntiva della specie isolata.
Terreni di arricchimento
Sono terreni che consentono di aumentare la carica della specie
batterica che ci interessa isolare, grazie alla presenza di fattori che
inibiscono la crescita di specie batteriche contaminanti presenti nel
campione in esame.
ESEMPIO DI TERRENO DIFFERENZIALE
a - b - g - emolisi
su piastra di agar
sangue
Terreni selettivi e differenziali
 selettivi perché favoriscono la crescita
di determinate specie batteriche
inibendone altre
 differenziali perché permettono la
crescita di colonie dello stesso genere
ma di specie diverse
ESEMPIO DI TERRENO
SELETTIVO E DIFFERENZIALE
Fermentazione
del mannitolo
in piastra di
MSA
ASETTICITA'
Le finalità :
 ottenere e mantenere pure le colture di
microrganismi
Una “coltura pura” è costituita solo da una
specie di microrganismo. La contaminazione
delle colture è a rischio in quanto i microbi si
trovano ovunque, sulla pelle, nell’aria.
 volgere il lavoro in un laboratorio di
microbiologia in sicurezza
Le regole fondamentali
di asetticità sono:
 la fiamma del bunsen in uso deve essere
ossidante, blu e alta circa 5 cm
 quando il bunsen non si usa si deve lasciare
la fiamma gialla, in modo da poterla vedere
facilmente
 sterilizzare la vetreria e il materiale usati
 disinfettare e pulire il banco da lavoro
accuratamente
 sistemare tutto il materiale utilizzato in
modo corretto