Transcript CRECIMIENTO MICROBIANO 12

CRECIMIENTO MICROBIANO
El crecimiento se define como un incremento
en el número de células
 En procariotas continúa hasta que se divide
en dos nuevas células en un proceso llamado
fisión binaria
Cada célula hija recibe un cromosoma
completo y copias suficientes de
macromoléculas, monómeros e iones
inorgánicos para vivir en forma independiente
Bajo condiciones nutricionales estables la
bacteria E. coli puede completar su ciclo en 20
minutos
 El tiempo es variable y depende de factores
nutricionales y genéticos
CRECIMIENTO POBLACIONAL
La velocidad de crecimiento es el cambio
en el numero de células por unidad de
tiempo
 El tiempo de generación es el requerido
para duplicar una población de células
 Este modelo en el que el número se
duplica por unidad de tiempo se denomina
crecimiento exponencial
 Una característica es que al comienzo es
bajo y luego incrementa en una explosión del
numero de células
 Se utiliza para ensayar el efecto positivo o
negativo de algún tratamiento sobre el cultivo
bacteriano
TIEMPO DE GENERACION
 En un cultivo creciendo exponencialmente hay una relación directa entre
el numero de células presentes en el momento inicial (N 0) y en un momento
determinado del crecimiento
N = N0 * 2 n
donde N= número final de células y n= número de generaciones
 El tiempo de generación “g” de la población celular se calcula
como:
g = t/n
donde t= horas o minutos
 Los tiempos de generación son usados para ensayar efectos positivos o
efectos negativos
CICLO PROCARIOTICO
 Antiguamente se pensaba que los ciclos bacterianos carecían de eventos
calve dado que no hay mitosis y la síntesis de ADN parecía continua durante
todo el ciclo
 En la actualidad se conocen fenómenos clave : fase C o de síntesis del ADN
(equivalente a la S eucariótica); replicación del ADN; fase D que termina con
el final de la división celular (equivale a la M eucariótica) ; fase de intervalo
(similar a la G1 eucariótica)
 Las fases C y D son relativamente constantes y cuando disminuye el tiempo
de generación (g) lo hace a expensas de la fase G1 . En el caso de E. coli la fase
C= 40 minutos y la fase D= 20 minutos
 Cuanto más rico es un medio , el tiempo de generación es menor y mayor es
el tamaño medio de las células
 Si se inocula una célula cultivada en un medio pobre (g=60 min, C+D= g) a
un medio más rico (g=35 min) se observa: la primera división ocurre a los
60min idéntico al medio anterior , pero el inicio de una nueva ronda de
replicación ocurre antes (C+D se superponen) y se obtiene un tamaño mayor
que en el medio pobre y una masa de inicio mayor
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
 Una población bacteriana presenta un patrón de crecimiento
cuando se inocula en un medio de cultivo fresco cerrado (líquido o
sólido)
 En estos sistemas la fase exponencial de crecimiento dura sólo
unas cuantas generaciones debido al agotamiento de nutrientes
y/o acumulación de desechos
 En estos sistemas hay una fase de latencia (fase lag) de
retraso mientras las células se ajustan a las nuevas condiciones es
un período de ajuste metabólico que depende del tamaño del
inóculo, bondad del inóculo (estado metabólico previo)
 Fase exponencial o fase logarítmica de crecimiento
continuo donde se da un crecimiento balanceado no restringido
durante unas pocas generaciones (menos de 10), el valor de (g)
dependerá de la composición del medio, temperatura, pH,
osmolaridad
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS
 Fase estacionaria se caracteriza porque el coeficiente de crecimiento se hace
nulo pero aun existe crecimiento que se equilibra con las muertes celulares, se
agotan nutrientes especiales y se acumulan sustancias de desecho, incluso el pH
se hace inadecuado, aun hay reacciones metabólicas pero el metabolismo es
diferente (células son más chicas) al de la fase logarítmica , el citoplasma se
condensa, la membrana se hace menos fluida y suele ser más resistente a los
agentes físicos y químicos
 Fase de muerte si la incubación continua en la fase estacionaria, las células
empiezan a morir y hay incluso lisis celular , es también una función exponencial
pero más lenta que la exponencial
CULTIVOS EN SISTEMAS CERRADOS SÓLIDOS
 Un medio sólido es una solución nutritiva (como el líquido), pero
incorporado a un gel, que le da consistencia.
 Los tipos de gelificantes más usados para los medios sólidos: agar-agar (o
simplemente, agar) es el más usado; gelatina (tiene el inconveniente que se
licua a temperaturas relativamente bajas)
 Los medios sólidos se suelen inocular mediante asa de siembra o espátula,
diseminando las bacterias sobre su superficie libre, en placas de Petri .Tras la
incubación a la temperatura y condiciones adecuadas, cada bacteria o
agrupación bacteriana da origen, por crecimiento, a una acumulación de células,
visible a simple vista, denominada colonia
 La densidad de cada colonia es muy alta (del orden de 107 células para una
colonia de unos 5 mm). Se debe a que las bacterias no pueden dispersarse, y
durante mucho tiempo este medio sólido permite un aporte continuo de
nutrientes y eliminación continua de productos de desecho. Por lo tanto, se
parece a un cultivo continuo, excepto que no hay drenaje de células.
 Con vistas a la determinación taxonómica, se suele tomar nota de una serie
de características de las colonias: tamaño, forma general y de bordes, color,
consistencia, aspecto de la superficie y elevación sobre el sustrato
MEDICION DEL CRECIMIENTO
CAMARA DE
PETROFF HAUSSER
 Se puede medir siguiendo los cambios en el número
de células o el peso de la biomasa celular
 El número de células se puede medir al microscopio
y se llama recuento directo
Se puede realizar en muestras secas o líquidas para las
que se usan cámaras especiales de recuento donde el
valor de células es convertido a células por mililitro de
suspensión
 Càmara de Petroff Hausser: portaobjeto especial
con graduación en superficie y medidas concretas:
 0.02 mm de profundidad
 área de 1 mm 2 dividida en un retículo de 25
cuadrados grandes
 cada cuadrado grande está subdividido a su vez en
4 x 4= 16 cuadrados pequeños
 la muestra se distribuye en 16 x 25= 400 celdillas
MEDICION DEL CRECIMIENTO
 La muestra dispensada entre porta y cubre se deja
reposar unos minutos y se cuenta el número de células
en varias celdillas (en general 16 equivalente a un
cuadrado grande), se anota el número n y se establece:
n x 25 x 50 x 1000 = concentración en células / ml
 Limitaciones:
 las células vivas no se distinguen de las muertas
 las células pequeñas son difíciles de apreciar
 se requiere habilidad para obtener precisión
se necesita contraste de fases cuando la muestra no
está teñida
 no es bueno para suspensiones poco densas, sólo sirve
para suspensiones concentradas ( mayores a 10 x 10 6
cel./ml)
RECUENTO DE
VIABLES
 El recuento en placa determina el número de células capaz de generar
colonias sobre la superficie de un medio sólido
 Hay dos formas, por siembra en superficie: se siembra 0.1 ml de muestra y se
extiende por la superficie con una barra de vidrio o metal
 O bien, por siembra en profundidad: se siembra de 0.1 a 1.0 ml en la placa de
Petri y se agrega el medio sólido fundido (40 ° C) y se incuba
 Por este método se pueden usar volúmenes más grandes
 Hay que tener en cuenta que el organismo a ser contado resista temperaturas
de 40 a 45° C
 El número de colonias que puede ser contado oscila entre 30-300 colonias
DILUCIONES
 Cuando el cultivo es denso se usa
el método de diluciones
 Se usan diluciones seriadas en
base 10: 1.0ml de muestra en 9.0ml
de diluyente o bien, 0.5ml muestra
en 4.5ml de diluyente
 El número de colonias depende
del inóculo , medio de cultivo y las
condiciones de incubación (medio
de cultivo, temperatura y tiempo de
incubación)
 La expresión del resultado será
como unidades formadoras de
colonias por mililitro (ufc/ml) ya
que la ufc puede contener más de
una célula
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
 Medida de la masa bacteriana: Métodos directos
Se puede determinar el peso seco donde la masa seca (estufa a 105 º C toda
la noche) es aproximadamente entre el 10 al 20% de la masa húmeda
 Inconvenientes: método tedioso que requiere tiempo y errores en pesadas ( 1
mg de peso seco equivale a una masa bacteriana de 5 x 10 9 bacterias)
 o bien, el peso húmedo donde se centrifuga y se elimina el sobrenadante y
se determina el peso del sedimento
 Inconvenientes: grandes errores debido al líquido intercelular retenido, tipo
y forma de las agrupaciones de la cepa, etc
 Determinación de componentes característicos: peptidoglicano, ARN,
ADN, proteínas se usan en bacterias que forman grumos no dispersables o
crecen en filamentos en general se emplean en determinaciones en ambientes
naturales
 Métodos indirectos :
Turbidimètricos (ópticos): la base común consiste en la medición de la
cantidad de luz dispersada o trasmitida a través del cultivo bacteriana. La
dispersión de la luz dentro de ciertos limites es proporcional a la masa del
cultivo
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
 Escala de Mc Farland: es una
serie de patrones de turbidez
(precipitado de SO4 Ba) previamente
calibrados y se establece la
equivalencia entre la turbidez de
cada tubo y la masa o concentración
de bacterias (células/ml) que genera
una turbidez similar
 Un método más útil es la medida
de turbidez con fotómetro o
espectrofotómetro que hacen pasar
luz a través de las suspensión celular
y detectan la cantidad de luz no
dispersada
 Los resultados se expresan en
unidades fotométricas o
unidades de densidad óptica
proporcionales al número de células
y a la masa celular
MASA CELULAR Y TURBIDEZ
Hay que realizar una curva estándar
de calibración que relacione medidas
directas (recuento en placa o
microscopía) con las indirectas de
turbidez
 En el método de turbidimetría es
necesario determinar el contenido de
ufc/ml de la muestra original (de la cual
se hicieron las diluciones para la
calibración) con el método de recuento
en placa.
 Con esta información y las
absorbancias de las diluciones, se hace
una curva de calibración. Teniendo esta
curva, se podrá determinar las ufc/ml de
otras muestras luego de leer la
absorbancia de las mismas.
 Contadores electrónicos de
partículas : se pasa una suspensión
bacteriana por un tubo capilar entre los dos
polos de una corriente eléctrica
 Cada vez que pasa una bacteria se
interrumpe la corriente y es recogida por un
dispositivo electrónico que detecta el
numero y tamaño de las partículas que van
pasando (el tamaño es función de la
intensidad del pulso de voltaje al paso de la
partícula)
 Citometría de flujo activada por
fluorescencia (FACS): las partículas se
marcan antes con anticuerpos
monoclonales hacia alguna molécula de
superficie y se unen a un fluorocromo
(molécula que se excita al absorber la
radiación láser y emite fluorescencia a
diferente longitud de onda)
EL QUIMIOSTATO
 Es un reactor que mantiene el
crecimiento bacteriano en la fase
exponencial
Es un cultivo continuo el volumen se
mantiene constante (recambio entre
medio fresco y usado) y se alcanza un
estado de equilibrio entre el número de
células y su estado metabólico
 Es un cultivo balanceado mantenido por
tiempo indefinido por un sistema de flujo
que se compone: una cámara de cultivo de
volumen constante a la que llegan
nutrientes y de la que se eliminan los
productos tóxicos de desecho
 Características: estado constante o
estable; concentración bacteriana y
concentración del sustrato: constante; tasa
de dilución y rendimiento celular:
constante
Se usan dos elementos de control: la velocidad de dilución y la
concentración del nutriente limitante (C o N)
 La velocidad de dilución controla la velocidad de crecimiento en rangos muy
amplios y la densidad celular (células/ml) esta controlada por el nivel del
nutriente limitante
 Los parámetros a tener en cuenta son: f (ml/h); volumen cámara de cultivo
(ml); densidad celular (x); factor de dilución D=f/v (h -1)
 Si logramos que el coeficiente de crecimiento (m) se haga igual al factor de
dilución (D), entonces dx/dt=0 y por tanto la cc de las células se hace constante
(x=x) y el cultivo se encuentra en estado dinámico de equilibrio
EL QUIMIOSTATO
 Los MO pueden cultivarse en una amplia gama de tasas de crecimiento
exponencial y permite crecimientos balanceados y restringidos ya que el
nutriente o sustrato está presente en una concentración baja como para limitar la
densidad de población
 Sin embargo, a tasas altas de dilución la concentración microbiana cambia
rápidamente y el cultivo puede ser lavado totalmente (dilución crítica)
 A muy bajas diluciones el quimiostato no funciona si el nutriente limitante es
la fuente de energía ya que sólo se usa para reacciones de mantenimiento celular y
no para crecimiento (energía de mantenimiento) como ser potencial de
membrana, trasporte activo o síntesis de proteínas
EL QUIMIOSTATO
 Aplicaciones:
Procesos industriales de fermentación (producción de bebidas alcohólicas, de
antibióticos, de aminoácidos, etc)
 Permite estudiar: aspectos fisiológicos (catabolismo de sustrato limitante),
selección de mutantes ; estudios ecológicos
 Su aplicación más conocida es para la depuración de aguas ya sea
mediante procesos aeróbicos o anaeróbicos . El “medio de cultivo fresco” es el
agua residual que entra en la planta y alimenta a los fangos activados por MO
que luego se retiran por decantación
EL QUIMIOSTATO
FACTORES AMBIENTALES
 El abanico es amplio y va desde puntos por debajo de la congelación del agua
hasta 110° C, el rango habitual es 30° C
 Se distinguen cuatro grupos:
Psicrófilos con temperaturas bajas 0-20 º C,
Mesófilas con medianas 20-45 º C,
Termófilas más altas 60- 90° C
Hipertermófilas con muy altas 90-110 º C
 Congelación: existe un límite por el cual es imposible la reproducción, hay
crioprotectores (glicerol y dimetilsulfóxido) que permiten su conservación a
temperaturas (-70 ° C)
 Termofilia: termófilos poseen membranas ricas en ácidos grasos saturados
que les dan estabilidad a altas temperaturas. Las eucariotas están ausentes por
encima de
60 ° C debido a la porosidad de sus membranas
 La temperatura favorece reacciones del metabolismo bacteriano:
-Acelera su capacidad de síntesis
-Velocidad de multiplicación más rápida
Regla de Van´t Hoff: "la velocidad de las reacciones químicas se duplica por cada
incremento de 10º C de la temperatura
FACTORES AMBIENTALES
Cloruro de
Sodio
Cloruro de sodio: el agua de mar tiene una concentración del 3% , los
organismos que se aíslan del mar tienen requerimientos específicos para el sodio
y se llaman halófilos pudiendo ser:
 Moderadamente halófilo (6-15%),
 Discretamente halófilo (1-6%),
 Halófilos extremos (15-30%)
pH y ACTIVIDAD DEL AGUA
 Acidez y alcalinidad - pH: sólo unas pocas especies pueden crecer a pH
extremos, la mayoría de los ambientes naturales tiene 5.9. Según su tolerancia al
pH:
 Los que crecen a pH ácidos (1-5.5) son acidófilos
 Los que crecen a pH básicos (8.5-11.5) alcalófilos
 Los que crecen a pH neutro (5.5-7.0) neutròfilos
 La mayoría de las bacterias tienen su pH óptimo (exterior) entre 5-9 y
cambian el pH de su hábitat acidificando o alcalinizando y con ello facilitan o
impiden la supervivencia de otras especies bacterianas.
 Acidógenas: acidifican su entorno al liberar productos ácidos
 Acidúricas: crecen en un medio ácido y son capaces de hacerlo más ácido
 Actividad el agua: la disponibilidad el agua se expresa en términos físicos
como actividad del agua (a w) y sus valores oscilan entre 0 y 1
 Osmosis: es el proceso por el que el agua difunde desde una región de alta cc
(baja en soluto) a una región de baja cc (alta en soluto)
 Plasmólisis: se produce cuando la célula está en ambiente con baja actividad
del agua y existe una tendencia de salida del agua intracelular
NECESIDADES DE OXIGENO
Bacterias aeróbicas estrictas: utiliza concentraciones del 20% más de
Oxígeno
Metabolismo : Alimento + O2 → Material celular + CO2 + H2O
Microaerófilos: necesita concentraciones muy bajas de Oxígeno. 2-10%. Tienen
superóxido dismutasa (SOD) y pueden o no tener catalasa
Bacterias anaeróbicas estrictas: No tolera nada de Oxígeno. Les resulta tóxico
y mueren, solo crecen si hay 0.5%. No tiene ni SOD ni catalasa
El oxigeno es un tóxico, su metabolismo es:
Bacterias anaeróbicas facultativas: utiliza oxígeno solo si lo hay. No tiene
problema para sobrevivir pero si hay oxígeno crece más rápido, 2-8%, tienen
SOD y catalasa
Anaerobio aerotolerante: no necesita oxígeno para crecer y multiplicarse.
Tolera el oxígeno pero no lo utiliza. Tienen SOD pero no catalasa
NECESIDADES DE OXIGENO
 El Oxígeno es tóxico para algunos porque no tienen las enzimas SOD y
catalasa, que degradan a los radicales libres del Oxígeno que son tóxicos. Con
estas enzimas (SOD y Catalasa), las bacterias pueden vivir con oxígeno
 El consumo de oxígeno es necesario para la respiración celular (para
obtener ATP)
 Toxicidad del Oxígeno: elementos tóxicos:
 H2O2: Peróxido de Hidrógeno
 O2- : radical superóxido
 OH- : radical hidroxilo
 Enzimas que intervienen:
 Superóxido dismutasa: 2 O2 + 2 H+------H2O +O2
Catalasa o peroxidasa: H2O2--------------H2O + O2