Transcript experiments_id_0

Электрофорез и Блоттинг
Наталья Володина
Молекулярная Биология 12.02.2011
Принципы
• Нуклеиновые кислоты (ДНК, РНК) двигаются от
отрицательного к положительному полюсу в
процессе электрофореза в геле
• Скорость передвижения зависит от размера
молекулы
•
Агарозный и акриламидный
гель
Акриламид – это синтетический полимер,
используемый для разделения фрагметов ДНК размером
в несколько сотен пар оснований
– Вначале его полимеризуют добавляяя специальные
компоненты
– Получается прозрачный гель, используемый обычно в
вертикальном аппарате
• Агароза – это полисахарид, используемый для
разделения молекул ДНК и РНК размером от
нескольких сотен до десятков тысяч пар оснований
– Гель создается нагреванием до кипения смеси агарозы и воды
до ее растворения и остыванием геля в специальной форме
– Получается полупрозрачный гель, обычно используемый в
горизонтальном аппарате
Рестрикционные ферменты
• Происхождение и природная функция
– Некоторые ферменты используются бактериями для
защиты от чужеродной (предполагается, что
вирусной) ДНК
– Бактериальная ДНК может быть метилирована в
определенных местах
• Рестриктазы не могут порезать последовательность,
которая была метилирована
• А вирусная ДНК неметелирована и таким
образом уничтожается рестриктазами
• Рестриктазы
– Обычно бактериального
происхождения
Ферменты
• Но могут происходить от низших
эукариот (простейших), и даже
вирусов и.т.п.
– Режут ДНК в определенных
коротких палиндромных
последовательностях
• Длиной 2 и больше нуклеотидов
• До 30 нуклеотидов
• В результате получается 5’
фосфат и 3’ гидроксильная
группа
• Могут получиться
одноцепочечные концы или
двухцепочечные (затупленные
концы)
• Места разреза могут быть
комплементарно соединены
вместе и далее склеены
ковалентно ДНК лигазой
• Средний размер фрагмента зависит от
количества нуклеотидов в узнаваемой
последовательности
Размер
узнаваемой
последовательнос
ти
4
5
6
8
Средний размер
фрагмента
256
1024
4096
65536
Агарозный
электрофорез
• Гель загружается образцами
порезанной ДНК и
прогоняется под
электричеством от 5 минут
до 2-3 часов
• Затем гель окрашивается
раствор бромида этидия,
который связывается с ДНК
– Это вещество светится под
ультрафиолетовой лампой
Определение размера
фрагмента ДНК
• Используются маркеры
размера
– Это 2х цепочечные фрагменты
ДНК известного размера
– Растояние пробега может быть
измерено прямо в геле с
помощью линейки
– Или с помощью диаграммы
100000
Nucleotide base pairs
• Пробег имеет обратное
логарифмическое отношение
к размеру фрагмента ДНК
Migration versus size
10000
1000
100
0
2
4
6
Distance migrated in cm
8
Разрезание человеческой
хромосомной ДНК
• Если используется фермент,
узнающий
последовательность в 6 п.о. –
получается 750 000
фрагментов
• На геле получается размазанная
дорожка
– Средний размер фрагментов
от или больше 4096 п.о.
– Повторяющиеся
последовательности могут не
содержать данную
последовательность
– Если последовательность
узнавания находится внутри
повторяющихся
последовательностей, то
появиться отдельный бэнд –
полоска на геле в размазанной
дорожке
• Индивидуальные последовательности в агарозном
геле могут узнаваться путем гибридизации по
Саузерну
Southern
Blot
– ДНК в геле денатурируется путем инкубации в
гидроксиде натрия
– ДНК затем переносится на мембрану из специального
материала
• Это процедура блоттинга
• ДНК оказывается на поверхности и таким образом она
может свяываться с комплементарными
последовательностями
• ДНК на мембране затем гибридизуется с короткой
последовательностью, называемой пробой
Проба
• Олиго или поли-нуклеотид,
представляющий собой известную
последовательность
– Обычно комплементарна какому-то гену
– Либо одноцепочечная с самого начала или
двухцепочечная и денатурирована перед
употреблением
– Помечена радиоактивным изотопом
фосфора или флюоресцентной меткой
Гибридизация
• Мембрана пре-гибридизуется
с неспецифической ДНК,
чтобы заблокировать
неспецифические сайты на
ДНК
• Потом она гибридизуется с
пробой
– Температура и условия
раствора могут быть изменены
для наилучшей гибридизации
– Одноцепочечная проба находит
комплементарную ей ДНК и
образует двойную спираль
– Несвязанная проба затем
отмывается
Экспозиция на
специальную фото
пленку в случае
радиоактивной метки
– Радиоактивная проба
засвечивает пленку так как
она выделяет электроны –
бета частицы
– Флюоресцентная проба
катализирует реакцию,
производящую свечение при
добавлении субстрата
• Проявление пленки дает
ауторадиограмму
– Полоски (бэнды) на пленке
показывают наличие данной
рестрикционного фрагмента с
последовательностью,
комплементарной пробе.
• Саузерн блоты
– ДНК режется рестриктазами и фрагменты
разделяются с помощью электрофореза
– Содержимое геля денатурируется и
переносится на мембрану
– ДНК затем гибридизуется с пробой,
комплементарной интересующей нас
последовательности
– Несвязанная ДНК смывается и мембрана
проявляется на фотопленку
– Вариация метода с использованием РНК
обычно в полиакриламидном геле
называется Нозерн (Nothern) блоттинг
Весь
процесс
Метод полиморфизма
рестрикционных фрагментов
• Хромосомная ДНК 2х разных людей
различается случайными полиморфизмами
– Существуют миллионы SSP - single nucleotide
polymorphisms
• Если эти вариации приводят к созданию или
разрушению рестрикционного сайта, то и
получившиеся фрагменты будут различаться
на Саузерн блотах
Пример 1 – точковая мутация
• Последовательность содержит 2 Eco R1
последовательности, разделенные 4000
нуклеотидов
• Мутация в одной из 2х хромосом у одного из
сравниваемых людей создала новую Eco R1
последовательность внутри исследуемого гена
– Получилось 2 фрагмента 1500 and 2500 п.о.
– Проба комплементарна к последовательности
лежащей внутри последовательности длиной 2500
п.о.
– Детекция метод Саузерн блота даст 1 фрагмент
4000 п.о. от нормальной хромосомы и 2 фрагмента
от мутантной хромосомы
DNA from normal individual
digested with Eco R1 and
electrophoresed through agarose
DNA from mutant individual digested
with Eco R1 and electrophoresed
through agarose
Northern blotting
• Используются для сравнения количества РНК
в клетке (обычно полиА РНК, т.е. мРНК)
• Процедура такая же как для Саузерна
• РНК должна быть денатурирована до и во
время электрофореза, чтобы предотвратить
образование вторичных стуктур
• Интенсивность бэндов может быть измерена
методом денситометрии, что косвенно
показывает количество мРНК в клетке
• Для чего это нужно знать?
Электрофорез белков
• Белки не имеют постоянную величину
отношения размера и заряда
– Метод электрофореза заставляет белки принять
постоянные величины размера и заряда
SDS-полиакриламидный гель
для электрофореза белков
• Белковый экстракт, выделенный из клеток,
кипятится 3 минуты в растворе детергента SDS и
бета меркаптоэтанола, который разрывает
дисульфидные связи.
– Детергент разрывает третичную и вторичную
структуру
– Детергент, который имеет негативный заряд,
вытягивает и покрывает молекулы белка своим слоем
– Таким образом молекулы белка мигрируют в геле от
отрицательного полюса к положительному в
соответствии со своим размером, который может
быть определен с помощью маркеров – см. пример
Western
blotting
• Измеряют количество
специфического белка в геле
• Белки, содержащиеся в
полиакриламидном геле,
переносятся на мембрану
• Проба - антитела
• Антитела помечены специальной
меткой – например
люминесцентной
• Интенсивность сигнала
показывает уровень экспрессии
• В случае мутации белок может
получиться короче – в каких
случаях?
Клонирование
• Приготвление ДНК вставки и
вектора (в основном,
бактериальной плазмиды)
– Обе ДНК режутся
рестрикционным ферментом,
оставляющим т.н. липкие концы
- маленькие участки
одноцепочечной гомологичной
ДНК
– Вектор и вставка смешиваются
Липкие концы слипаются
и ДНК лигаза склеивает двойные
спирали
• ДНК вводиться в клетки
бактерий например если
плазмида была бактериальная
• Клетки растут и
размножаются и
соответсвенно увеличивается
и количество ДНК
Зачем
клонировать?
• Аналитические цели
– Последовательность ДНК и
структура и функция гена и
производного белка могут быть
изучены если этот ген
изолирован из контекста целого
генома и клонирован
• Практические цели
– Изолированный ген может
быть экспрессирован in vivo или
in vitro
– Коммерческие цели
– Терапевтические цели
– Примеры?
• Манипуляции, чтобы изменить
структуру белка
Какие?
– Получить много идентичных
копий одного и того же гена
Реагенты для клонирования
• Ферменты и буферные растворы
– Рестрикционные ферменты
– Лигаза
– Иногда в случае клонов кДНК – обратная
транскриптаза
• Что такое кДНК и зачем она нужна? См. ниже
• Векторы
• Принимающие клетки
ДНК
лигаза
• Из бактериального вируса T4
• Реакции проходят при
пониженной температуре так
как этот фермент легко
разрушается
• Может склеить порезанные
концы ДНК
• Обычно ДНК нагревают
после рестрикции, чтобы
денатурировать
рестрикционные ферменты и
чтобы они больше не резали
Обратная
транскриптаза
• Конвертирует ДНК в РНК,
чтобы она могда быть
клонирована – кДНК
• oligo dT используются как
праймеры для обратной
транскрипции
ОТ делает одноцепочечную ДНК
• РНК затем разрушается
специальным ферментом и
проводят синтез 2й цепи ДНК
Существуют различные способы
Векторы
• ДНК с независимым ориджином репликации
(про- и/или эукариотическим) и маркерами
селекции и экспрессии
– Маркер селекции позволяет клетке выжить в
летальных условиях, например – в присутствии
антибиотиков
– Маркер экспрессии позволяет увидеть наличие гена
например GFP – green fluorescent protein!
– Плазмиды, вирусы или искусственные хромосомы
PBR322
• Уже не используется
коммерчески
• PBR322 имеет 2 гена
устойчивости к
антибиотикам
– Amp and tet
• Есть один сайт узнавания
для фермента Bam H1 в
гене tet
– Клонирование ДНК в этом
сайте разрушает ген tet
Принимающие
клетки
• Могут быть прокариотические
и эукариотические
• Принимают рекомбинантную
ДНК
– Технические подходы введения
ДНК в бактериальные клетки
• Прямо добавить ДНК
– Трансформация
» В случае бактерий
– Трансфекция
» Бактерии принимают
вирусные векторы
» Эукариоты принимают
любые векторы, например
липосомы !
» В присутствии CaCl2
• Электропорация
– ДНК в клетки загоняется с
помощью электр. поля
• Должны поддерживать
рекомбинантную ДНК и белок
• Должна пройти
рекомбинация ДНК
• В случае бактерий, селекция
может производиться на
среде с определенными
антибиотиками
– ДНК должна быть очищена
перед тем как ее внести в
вектор, например методом
очистки ДНК фрагментов из
геля
– Колонии бактерий,
содержащие внесенную ДНК,
также могут быть
проскринированы с помощью
комплементарной
радиоактивной пробы
Скрининг
колоний
Что делать с ДНК?
Принимающие клетки могут быть размножены и ДНК таким образом
амплифицирована
• Секвенировать
– Может быть сделано прямо на очищенной ДНК
• Экспрессировать
– Можно наработать много белка
• Мутировать
– Возможно внести специфические мутации,
например методом ПЦР мутагенеза
• Можно изучать функции разных доменов получившегося
белка
• Можно изучать различные промоторы и энхансеры
Примеры медицинской
значимости
• Диабет (особенно Инсулино-зависимый)
– Когда существует дефект клеток, производящих
инсулин
– Требуется искусственный инсулин
• Инсулин, выделенный из других животных, может
вызвать иммунную реакцию
• Человеческий инсулин был клонирован и
экспрессирован вначале в бактериях
– Но проблема в том, что бактерии не поддерживают посттрансляционной модификации про-инсулина
http://www.diabetesdaily.com/wiki/images/2/25/Insulinpath.png
В настоящее
время
• Полная
последовательность
кДНК клонирована в
дрожжах (простейших
эукариотах)
• Дрожжи – это
одноклеточные
эукариоты и
следовательно они
содержат ЭР и
сигнальную пептидазу и
они были генетически
модифицированы, чтобы
содержать пептидазу,
отрезающюю С-пептид
Какие следующие проблемы на
пути доступности инсулина?
FISH
• http://en.wikipedia.org/wiki/Fl
uorescent_in_situ_hybridizatio
n
Ресурсы Интернета
http://www.hhmi.org/biointeractive/
vlabs/bacterial_id/index.html
http://www.ornl.gov/sci/techresourc
es/Human_Genome/posters/chromo
some/tools.shtml
http://www.ebi.ac.uk/Tools/