Transcript （1）PCR定点诱变
PCR诱变 PCR诱变 （1）PCR定点诱变 （2）几种碱基变化的PCR引入 （3）PCR随机诱变（易错PCR） 一、PCR定点诱变 应用PCR原理，可以直接进行定点诱变，并 且不需要采用噬菌体M13. 首先，把需诱变的基因克隆于质粒上，把 带有诱变目标基因的质粒，分成两个反应管， 每个反应管加入不同的引物，每个反应管的 一对引物中，有一个引物需按诱变意图改变 碱基，即该碱基是错配的，每对引物的互补 位置不同，同一管中每条几乎处于同一起点 但放向相反。 经PCR后，每个管产生了含有改变了特定碱基 的产物，但留有缺口。因此，产物是线状的 DNA链，由于引物互补位置不同，两个管的产 物的缺口位置也不同，当把两个反应管的产 物混合，经变性和退火处理，来自不同反应 管的线状DNA链可杂交形成双链环状的DNA分 子，但仍有缺口。由于环化分子可以转化大 肠埃希菌，在体内可把缺口修复，这样可以 获得定点改变了特低碱基的基因。 1、重叠延伸PCR (over-lap extension PCR, OE-PCR ) 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 3、环状诱变 PCR 法 4、TAMS 定点诱变技术 1、重叠延伸PCR （OE-PCR） 首先设计两个PCR反应以产生两个含 突变位点的DNA片段，随后将上述两个 PCR产物混合，二者通过末端互补区结合 并在适宜的温度下互为引物延伸得到完 整的含突变的基因，对第一次PCR产物进 行纯化处理可显著提高突变效率 2、大引物PCR法（megaprimer PCR ) 先设置一个PCR反应产生一个含突变的DNA 片段，然后再以此DNA片段作为引物与原模板 退火进行PCR扩增得到含突变的完整的基因。 因为作为引物使用的DNA片段较通常的引物要 大许多甚至有上百碱基，所以命名为大引物 PCR法。 大引物PCR 定点诱变技术路线 （圆点指突变位点） 3、环状诱变 PCR 法 定义：以整个带有目的基因的质粒为模板，用诱变剂 进行扩增，最后产生环状的带有目的突变的质粒。 方法： ①两个引物反向、紧邻但没有重叠区，扩增产物是平 末端的线性DNA，需用T4连接酶环化处理。 ②以Stratagene公司开发的定点突变试剂盒为代表， 两个引物也是反向的并且其5’端有l5个碱基以上的 重叠区，扩增产物为带黏性末端的线性DNA，可自 行环化。 环状诱变 PCR 法 环状诱变 PCR 法 4、 TAMS定点诱变技术 有目的地扩增突变链定点诱变技术:能够一次引入多个 位点的突变，并且能够有目的扩增突变链，从而使突变链 效率几乎达到100% 1、线性单链DNA模板的制备。（线性PCR） 2、突变链的合成:用2个锚锭引物(Anchor5’和Anchor3’ ) 和多个诱变引物(Mut1和Mut2)，首先在多核苷酸激酶的作 用下使每个引物磷酸化，接着在DNA聚合酶的作用下使引 物与线性模板退火、延伸，最后在DNA连接酶的作用下。 合成突变链。 3、有目的地扩增突变链：设计扩增引物(PCR5和PCR3 )， 使其3’端碱基分别与锚锭引物引入的突变碱基配对，扩增 引物只能退火到突变链而不是亲本链，所以只有突变链才 能扩增。 TAMS定点诱变技术 二 几种碱基变化的PCR引入 首先，在诱变引物合成时，按设计使某位置发生 4种核苷酸均有出现的可能。例如，要合成一段含三个 G的引物，只要在G原料中加入一定比例的A、C、T，那么 可以出现在G位置上含G、A、T或C的产物。这段引物是 结合于基因上需要诱变的位置的。在PCR之前，需把目标 目标基因或序列克隆于质粒，并使目标基因两端的质粒上 均有内切酶切点，以方便把克隆片段切出。 扩增战略： 三、 PCR随机诱变 当对目的序列了解很少的情况下，需 要引入大量的随机诱变，构建突变库，再 逐个筛选和鉴定 策略 1、利用简并引物 2、易错 PCR (error-prone PCR ) 1、利用简并引物 简并引物的特点 5’端有十几个碱基是随机组合的。这一方 法除引物特殊外，其余均与定点突变技术完 全一样。利用简并引物可以产生大量随机突 变，并且这些突变都集中在很窄的一段区域 内。 2 易错PCR（error-prone PCR） DNA聚合酶在进行扩增目的DNA时会以一定的 频率发生碱基错配，这一现象恰好提供了一 种特定基因进行随机诱变的可能方法。 利用PCR过程中出现的碱基错配进行特定基因 随机诱变的技术就称为易错PCR。 原理：较低的聚合酶（如Taq酶）在特定措施 下很容易向扩增产物中掺入随机突变 方法：增加Mg2+ 的浓度、改变dNTP的比例、调 节热循环参数、利用Mn2+替代天然辅助因子 Mg2+ 、加入dITP（三磷酸脱氧核苷酸类似物） 此方法可获得改善活性和稳定性的突变产物， 但易错PCR一般只产生点突变，因此其产生的 突变体在多样性方面尚有一定缺陷。 连续易错PCR （sequential error-prone PCR ) 在通常情况下，经过一次易错PCR很难获得满 意结果，由此发展出连续易错PCR 将一次PCR扩增得到的有用突变基因作为下一 次PCR扩增的模板，连续反复地进行随机诱 变，使每一次获得的小突变累积而产生重要 的有益突变。