Transcript Profili genetici
Profili genetici
diagnosi genetica e screening genetico
Cenni di storia delle tecniche.
Alla metà degli anni 80 il ricercatore australiano Alan Trounson ipotizzò la possibilità di rimuovere, senza danneggiarlo, una cellula da un embrione allo stadio di 8 cellule.
Agli inizi degli anni 90 Alan Handyside, ricercatore a Londra, pubblicò la prima gravidanza ottenuta dopo biopsia degli embrioni per escludere il trasferimento di embrioni affetti da una patologia genetica Contemporaneamente, con un approccio diverso, Yury Verlinsky a Chicago, cominciò a produrre dati analoghi rimovendo il prodotto di scarto della cellula uovo prima e dopo l’avvenuta fecondazione. La tecnica, molto promettente e meno invasiva per l’embrione, soffre del fatto che, ovviamente, non è in grado di studiare la componente maschile dell’eventuale problema genetico o cromosomico.
BIOPSIA DELL’EMBRIONE
L’ovocita della coppia a rischio, una volta messo in presenza degli spermatozoi del partner, raggiunta la fecondazione comincia a dividersi raggiungendo dopo tre giorni lo stadio di 6-8 cellule (chiamati alla sua capacità di sviluppo successiva.
blastomeri
). In questa fase si esegue la biopsia dell’embrione. La biopsia embrionaria serve a prelevare una o anche due cellule totipotenti (blastomeri). Questo intervento non crea assolutamente alcun danno all’integrità dell’embrione e
BIOPSIA DELL’EMBRIONE
La biopsia dell’embrione prevede la rimozione di una cellula da un embrione allo stadio di 6 – 8 cellule. Con l’embrione mantenuto in posizione dalla pipetta con i margini arrotondati (a sinistra delle foto), si apre un foro nell’involucro che contiene l’embrione utilizzando una soluzione opportuna, espulsa da una micropipetta posizionata in corrispondenza della cellula che si intende rimuovere (A e B).
RIMOZIONE DI UNA CELLULA
Una volta perforato l’involucro, si inserisce in posizione una nuova micropipetta di diametro applicando una pressione negativa (D).
maggiore rispetto all’anteriore, che consentirà, mediante aspirazione, la rimozione di una cellula (C) che verrà poi rilasciata
Come si eseguono le tecniche di diagnosi
Una volta prelevata la cellula embrionaria (blastomero o globuli polari) PCR ed analisi di mutazione per le patologie mendeliane FISH per le patologie cromosomiche
FISH
Preparazione della cellula prelevata dopo biopsia dell’embrione. Il nucleo, liberato dal citoplasma che lo circonda, viene fissato su di un vetrino da microscopio e disidratato
segue l’ibridazione, cioè il processo mediante il quale sonde accoppiate a coloranti fluorescenti che renderanno visibili i cromosomi da analizzare, si uniranno in forma specifica al cromosoma corrispondente
Si procede quindi all’aggiunta di un colorante di contrasto e all’analisi al microscopio a fluorescenza
Il procedimento di ibridazione può essere ripetuto in forma analoga con altre sonde che riconoscono cromosomi diversi da quelli studiati nella prima fase
I segnali fluorescenti rilevati al microscopio indicano la presenza di due copie ognuno per i cromosomi 13 (rosso), 16 (azzurro), 18 (rosa intenso), 21 (verde) e 22 (giallo) dopo il primo ciclo di ibridizzazione (A); due copie dei cromosomi X (azzurro), 1 (rosso) e 15 (verde) risultano dal secondo ciclo di ibridizzazione effettuato sulla stessa cellula (B). Questa cellula è quindi classificata come normale per gli 8 cromosomi analizzati.
PCR
ANALISI DI SEQUENZA
Una volta ottenuto dopo PCR, il prodotto di amplificazione viene analizzato mediante sequenziamento automatico. La figura è relativa al sequenziamento della regione interessata da una mutazione puntiforme, indicata da una freccia nella striscia in basso, del gene che codifica per il Fattore VIII, proteina importante nel processo della coagulazione.
Una mutazione che ne causa la perdita di funzionalità porta alla condizione patologica nota come emofilia.
Una volta eseguita la diagnosi sul o sui blastomeri, si procede al trasferimento in utero di quegli embrioni risultati sani o portatori sani della malattia, mentre vengono esclusi dal trasferimento in utero solo quelli risultati malati.
Da una coppia portatrice di talassemia o di fibrosi cistica la distribuzione percentuale di embrioni malati, portatori sani e sani è rispettivamente, del 25%, 50% e 25%.
Se invece la coppia è costituita da un malato e da un portatore, gli embrioni saranno solo di due tipi e cioè, 50% malati e 50% portatori sani.
La PGD in Italia dopo la Legge 40: La Diagnosi Genetica Pre-concepimento
Nuova procedura che mira a selezionare gli ovociti in cui non sia presente l’anomalia genetica materna, in modo da produrre solo embrioni sani.
Studia i gameti femminili prima della sua fertilizzazione in vitro, mediante analisi genetica del primo globulo polare (1PB).
La diagnosi genetica viene, quindi, eseguita sull’ovocita e non sull’embrione.
Vengono superati i problemi etici che hanno determinato il divieto della diagnosi preimpianto (non si eliminano più embrioni affetti).
Con la diagnosi pre-concepimento si esclude a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche.
Biopsia dell’ovocita
La biopsia dell’ovocita avviene attraverso la rimozione del globulo polare (o dei globuli polari).
Il primo globulo polare si forma in seguito alla prima divisione meiotica prima della fecondazione, il secondo globulo polare viene espulso dall’ovocita già fecondato.
BIOPSIA DEI GLOBULI POLARI
Un ovocita fecondato, come indicato dalla presenza dei due pronuclei centrali, è sottoposto a biopsia dei globuli polari. L’ovocita è mantenuto in posizione da una pipetta a bordi arrotondati (sulla sinistra nelle foto); un sottile microago è introdotto all’interno dell’involucro che racchiude l’ovocita (A) mediante il quale, applicando una leggerissima aspirazione, si procede alla rimozione di entrambi i globuli polari (B).
Biopsia del primo globulo polare
Per prelevare i 1PB si effettua un’apertura parziale della zona pellucida, attraverso la quale s’introduce una micropipetta di vetro in grado di aspirare il 1PB. Terminata la biopsia, l’ovocita viene rimesso in coltura, mentre ogni 1PB viene introdotto all’interno di una provetta analitica per la successiva diagnosi genetica.
L’analisi genetica del 1PB
• Permette di identificare, in donne portatrici di una malattia
genetica, quegli ovociti che, all’analisi genetica, non presentano la specifica mutazione genica materna.
• Poiché il 1PB possiede un assetto genetico speculare a quello
dell’oocita, se il 1PB presenta la mutazione materna ne consegue che l’ovocita risulterà privo della mutazione (e quindi normale).
Viceversa, se il 1PB non presenta la mutazione materna, sarà l’oocita a contenere quella mutazione .
• Solo gli ovociti normali (senza la mutazione materna) saranno poi
fecondati con gli spermatozoi paterni mediante ICSI.
• In tal caso, gli embrioni ottenuti potranno essere al massimo
portatori della malattia (se lo spermatozoo conteneva la mutazione paterna), ma non saranno mai affetti dalla malattia.
L’analisi genetica dell’ovocita mediante diagnosi del primo globulo polare (1PB) (Diagnosi Genetica Pre-concepimento)
Nel protocollo di diagnosi genetica dell’ovocita mediante analisi del 1PB, i tempi da osservare sono strettissimi (al massimo 4-6 ore). Per questo motivo, l’applicazione della tecnica segue uno schema articolato che richiede una stretta coordinazione tra due diverse equipe , il team del laboratorio di PMA e quello del laboratorio prelievo degli ovociti.
di genetica molecolare. L’attività di questi due gruppi di professionisti consente di ottenere i risultati entro 6 ore dal
Aim of the study
to optimize a rapid protocol for testing single gene mutations of maternal origin on 1PBs, which fits with the new Italian regulation. The whole procedure should be completed within 4h, thus obtaining the results in time for a late ICSI (
6 h after oocytes collection).
To adapt the procedure for diagnosis of cystic fibrosis (CF) and ß-thalassemia (ßT) mutations, the two most common genetic diseases in the Italian population.
To perform a trial study on single lymphocytes and 1PBs, to evaluate the feasibility, reliability and limitations of the protocol prior to its clinical application Fiorentino et al. Prenat Diagn (In press)
Diagnosi Genetica Pre-concepimento: APPLICABILITÀ
La diagnosi pre-concezionale può essere applicata a coppie portatrici di malattie monogeniche a trasmissione: autosomica recessiva, legata al cromosoma X (X-linked) autosomica dominante di origine materna. Con questa procedura non possono essere individuati eventuali malattie genetiche a trasmissione autosomica dominante di origine paterna.
Da una valutazione retrospettiva dell’attività di diagnosi preimpianto effettuata dal ns. Centro dal 1998, emerge che la diagnosi pre concezionale sarebbe stata applicabile: in 30/37 differenti malattie genetiche (81.1%) Su un totale di 293 cicli di PGD effettuati per 189 coppie, il 95.9% (281/293) di questi sarebbero stati effettuabili anche applicando l’analisi del 1PB, riuscendo ad accettare il 95.8% (181/189) delle coppie che hanno richiesto di poter accedere ad un ciclo di diagnosi preimpianto mediante analisi degli embrioni
Diagnosi Genetica Pre-concepimento:
VANTAGGI
L’analisi è effettuata su materiale extra-embrionario, che non ha alcun ruolo biologico.
La biopsia del 1PB non incide sullo sviluppo dell’embrione, mantenendo inalterate le relative percentuali di impianto.
La diagnosi genetica viene quindi eseguita sull’ovocita, l’embrione non viene manipolato. Ciò previene la perdita di embrioni e consente di superare i problemi etici che hanno determinato il divieto della diagnosi preimpianto.
Utile per quelle coppie, portatrici di una malattia genetica, che non vogliono affrontare il rischio di un’interruzione della gravidanza dopo diagnosi prenatale.
Evita gli effetti del cd. “turismo riproduttivo”.
Diagnosi Genetica Pre-concepimento:
LIMITI
L’analisi consente di ottenere solo informazioni relative ad anomalie di origine materna, ed è quindi inapplicabile in caso di malattie genetiche autosomiche dominanti di origine paterna.
L’elevata incidenza di ricombinazione comporta l’inefficienza della metodica in circa il 50-60 % degli ovociti, riducendo quindi il numero di ovociti privi di mutazione genica disponibili per essere fertilizzati.
Una bassa risposta alla stimolazione ovarica incide sul numero di ovociti disponibili per l’analisi genetica. Una buona riserva ovarica, quindi, è un requisito indispensabile per il successo della procedura.
L’analisi non consente di effettuare la tipizzazione dell’HLA in fase preimpianto
Conclusioni
la diagnosi genetica pre-concepimento consente di superare un sentito problema etico: la manipolazione dell’embrione a fini diagnostici.
Utilizzando questa procedura, la diagnosi genetica viene eseguita sull’ovocita, e non sull’embrione.
A differenza della diagnosi preimpianto, che comporta l’esclusione di quegli embrioni che all’analisi genetica risultano affetti dalla specifica patologia genetica di cui la coppia è portatrice, con la diagnosi pre concepimento, invece, si esclude a priori la possibilità di produrre embrioni con anomalie genetiche.
L’opzione di un trattamento in Italia, mediante diagnosi genetica pre concepimento, eviterà alle coppie a rischio genetico i notevoli disagi di natura psicologica ed economica conseguenti al “turismo riproduttivo”
La diagnosi pre-concepimento può, inoltre, dare una speranza a molte coppie che non possono affrontare i costi di un trattamento all’estero, a causa delle limitate disponibilità economiche e ristabilire il diritto di equità di accesso alle pratiche sanitarie, diritto sancito costituzionalmente.