Transcript (секвенирование) ДНК

Институт аналитического приборостроения
Российской академии наук
В.Е. Курочкин
СОВРЕМЕННЫЕ ТЕХНОЛОГИИ АНАЛИЗА
НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ – ПОЛИМЕРАЗНАЯ
ЦЕПНАЯ РЕАКЦИЯ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ И
СЕКВЕНИРОВАНИЕ ДНК
28 марта, 2013 г.
Санкт-Петербург
Основные этапы молекулярно-генетических исследований
Пробоподготовка
Инактивация
Ручное
Выделение ДНК и РНК
Количественный анализ
методом ПЦР-РВ
Автоматизированное
Определение последовательности
(секвенирование) ДНК
Полимеразная цепная реакция в реальном
времени – ПЦР-РВ
Приборы для ПЦР-РВ
Основные характеристики:
• Принцип и скорости нагрева/охлаждения
• Формат термоблока
• Число каналов измерения флуоресценции
• Источник излучения
• Детектор
• Нагрев крышки термоблока
• Алгоритмы обработки данных
• Программное обеспечение
Приборы для ПЦР-РВ
Разработки ООО «ДНК-Технология», Россия
Принцип и
скорости
нагрева/
охлаждения
Формат
термоблока
Число
каналов
измерения
флуоресценции
Источник
излучения
Детектор
Нагрев
крышки
термоблока
Габариты
ШхГхВ, мм
вес
32 пробирки
по 0,2 мл
2
светодиод
ПЗСматрица
Есть
350х350х220
11 кг
Элементы
Пелтье
3,3°С / сек
2,1°С / сек
96 пробирок
по 0,2 мл
(опциональн
о
384луночный
планшет)
4
(5-й канал
опционально)
светодиод
ПЗСматрица
Есть
2I0х540х540
27 кг
Элементы
Пелтье
5°С / сек
2,5°С / сек
(для 48 блока)
3,5°С / сек
2°С / сек (для
192 блока)
48 (8х6)
пробирок по
0,2 мл
192 (16х12)
пробирок
4—5
470-750 нм
светодиод
ПЗСматрица
Есть
105°С
210х480х210
17 кг
Элементы
Пелтье
3°С / сек
2,5°С / сек
Разработки ИАП РАН
Принцип
и скорости
нагрева/
охлаждения
Формат
термоблока
Элементы
Пелтье
3°С / сек
2,5°С / сек
16 или 32
пробирки по
0,2 мл
Элементы
Пелтье
5°С / сек
3,5°С / сек
48
пробирок по
0,2 мл
8
Воздушное
З,5°С / сек
З,5°С / сек
4 пробирки
по 0,2 мл
4
Число
Каналов
измерения
флуоресценции
Источник
излучения
4-5
Детектор
Нагрев
крышки
термоблока
Габариты
ШхГхВ, мм
вес
Галогеновая
лампа
ФЭУ
9 порядков
Регулируемый
нагрев от
95 до 110°С
340х400х420
Галогеновая
лампа
ФЭУ
9 порядков
Регулируемый
нагрев от
95 до 110°С
340х400х420
ФЭУ
9 порядков
Регулируемый
нагрев от 95 до
110°С
З20х259х220
4 светодиода
26 кг
26 кг
5,5 кг
Уникальная оптико-тепловая схема
Оптическое световолокно
№
Возбуждение
Эмиссия
Красители
Ширина пропускания
1
480
520
FAM, Eva Green,
SyberGreen
+/- 30
2
490
530
FAM, Eva Green,
SyberGreen
+/- 15
3
530
550
R6G, HEX, JOE,
VIC
+/- 15
4
550
580
TAMRA, Cy3
+/- 15
5
580
610
ROX, Tex-Red
+/- 15
6
630
650
Cy5
+/- 15
7
670
700
Cy5.5
+/- 15
Элемент Пелтье
ФЭУ
Основные области приложения наших
разработок
• Диагностика возбудителя туберкулеза
• Диагностика возбудителей особо-опасных инфекций
• Судебно-медицинская генетика
• Диагностика однонуклеотидных полиморфизмов
• Диагностика возбудителей заболеваний растений и животных
• Научно-исследовательские работы в биологии, медицине, сельском
хозяйстве и др.
Диагностика возбудителя туберкулеза
Образец
Пробоподготовка, инактивация
Выделение ДНК
Анализ ПЦР-РВ
Протокол
• выявление ДНК МБТ
• дифференциация
• количественный
анализ
• устойчивость МБТ
• Мокрота
• Ручное
• Культура клеток
• Автоматическое
• Осадок
• Биологические
жидкости
Время исследования – 1 день
Первый этап – количественная оценка содержания ДНК
МБТ в образце
Автоматический анализ по шаблону
Второй этап – определение множественной лекарственной
устойчивости (МЛУ)
Автоматический анализ МЛУ по шаблону
Для образца 751 необходимо проведение исследования на устойчивость МБТ к
антибиотикам 2-ого ряда (широкую лекарственную устойчивость)
География лабораторий для диагностики
туберкулеза методом ПЦР-РВ
Регионы РФ, оснащенные лабораториями ИАП РАН и ООО «Синтол», отмечены зеленым цветом.
Вариант ПЦР-РВ лаборатории в мобильном
исполнении
Диагностика возбудителей карантинных и особо опасных заболеваний
Секвенирование ДНК в приборе
капиллярного электрофореза
Приборы для секвенирования ДНК на
основе капиллярного электрофореза
Идентификация личности по следам ДНК
Сравнение результатов, полученных на
приборе Нанофор-05М (ИАП РАН) и
ABIPrism3500 DNA Sequencer (США)
Нанофор-05М
Динамика роста лабораторий молекулярногенетических исследований
Ежегодно в России появляется несколько сотен лабораторий МГИ
рост числа лабораторий МГИ
15000
количество
12000
10000
7500
5000
5000
2500
500
0
2001
2005
2010
год
2012
2015
Целевые группы:
НИИ, ВУЗы, Университеты
медицинского, биологического
и сельскохозяйственного профилей
Медицинские центры (КДЛ)
Противотуберкулезная служба
Онкологические центры
Центры крови
Роспотребнадзор
Россельхознадзор
ФМБА
МЧС
ФСБ
Минобороны
И т.д.
Благодарю за внимание!