Transcript FluorescenciaDicroismo

Técnicas espectroscópicas
P
(I  I )
(I  I )
Vodka
Fluorescencia
Características de las moléculas fluorescentes
•
•
•
•
Molécula plana
Con dobles enlaces conjugados (generalmente aromáticas
Pares de electrones desapareados
Tamaño relativamente grande
Ejemplos de moléculas fluorescentes
N
O
OH
HO
O
NH2
N
H
Triptofano
O
H2N
H
OH
Tirosina
N
Quinina
O
H2N
OH
Fenilalanina
OH
Principio de Frank-Condon 10-15 s
Conversión
interna 10-12 s
S1→S0 10-12 – 10-8
Corrimiento de Stokes
Tiempo de vida y eficiencia
cuántica
• La eficiencia cuántica es la relación
entre el número de fotones emitidos
y el número de fotones absorbidos

Q
  knr
Cercano a la unidad
Donde Γ es la velocidad de
emisión del fluoróforo y knr
es la velocidad de
decaimiento no radiativo
• El tiempo de vida de la fluorescencia
determina el tiempo de permanencia del
estado excitado antes de retornar al estado
basal.
1

  knr
1

Moléculas similares con tiempos de vida y eficiencias cuánticas diferentes
Apagamiento de la fluorescencia
• Apagamiento colisional (estado excitado)
F0
 1  K Q   1  kq 0 Q 
F
Donde K es la constante de SternVolmer, kq es la constante de
apagamiento bimolecular, τ0 es el
tiempo de vida sin apagador y [Q]
es la concentración de apagador
Apagadores
•
•
•
•
Oxígeno
Halógenos
Aminas
Acrilamida
• Apagamiento estático: formación de complejos
no fluorescentes con el apagador.
Anisotropía de la fluorescencia
• Provee información sobre
el tamaño y la forma de las
proteínas o rigidez del
medio
• Asociaciones proteínaproteína, fluidez de la
membrana
• Fotoselección
r
(I  I )
( I  2I  )
P
(I  I )
(I  I )
Tamaños
Transferencia de energía por resonancia
(RET, FRET)
Transferencia de energía por resonancia
(RET, FRET)
O
OH
- Triptofano
NH2
N
H
- Intrínseca
O
- Fenilalanina
H2N
- Tirosina
Fluorescencia
HO
OH
O
H2N
OH
- Cloruro de dansilo
- Extrínseca
- 1-anilino-8-naftaleno sulfonato
Efectos de solvente
Dicroísmo circular
Debida a la absorción preferencial de luz circularmente polarizada
Radiación electromagnética
Polarización de la Luz
Interactive animations of
electromagnetic waves
András Szilágyi
Institute of Enzymology, Hungarian
Academy of Sciences
GNUPLOT:
equation
plotting
program
E
A
sin(
x
/


t)
y
Vertically (y axis) polarized wave having an amplitude A, a wavelength of and an
angular velocity (frequency * 2) of , propagating along the x axis.
Plane-polarized light
Vertical
E
A
sin(
x
/


t)
y
Horizontal
E
A
sin(
x
/


t)
z
Circularly polarized light
Right circular
E
A
sin(
x
/


t
90

)
y
E
A
sin(
x
/


t)
z
Left circular
E
A
sin(
x
/


t
90

)
y
E
A
sin(
x
/


t)
z
Interaction of light and matter: Absorption
Material with an extinction
coefficient 
The light gets weaker (its amplitude
drops)


x
E

Ae
sin(t
x
/


)
y
In
Out
Interaction of light and matter: Refraction
Material with an index of
refraction n
The light slows down inside the
material, therefore its wavelength
becomes shorter and its phase gets
shifted
E
A
sin(
nx
/


t)
y
In
Out
Circular dichroism
Material having different
extinction coefficients for
right and left circularly
polarized lights: R and L
Plane-polarized light becomes
elliptically polar







x


x
R
L
E

Ae
sin(
x
/

t

90

)

Ae
sin(
x
/

t

90

)
y
In


Out



x


x
R
L
E

Ae
sin(
x
/

t
)

Ae
sin(
x
/
t
)
z
Circular bi-refringence
Material having different
refraction indices for right
and left circularly polarized
lights: nR and nL
The plane of polarization of planepolarized light gets rotated


In


Out
E

A
sin(
n
x
/

t

90

)

A
sin(
n
x
/

t

90

)
y
R
L




E

A
sin(
n
x
/
t
)

A
sin(
n
x
/
t
)
z
R
L
Circular dichroism AND bi-refringence
Material having different
extincion coefficients AND
refraction indices for right
and left circularly polarized
lights: R and L AND nR
and nL
Plane polarized light gets elliptically
polar, with the great axis of the ellipse
being rotated relative to the original
plane of polarization








In
Out

x

x
R
L
E

Ae
sin(
n
x
/

t

90

)

Ae
sin(
n
x
/

t

9

)
y
R
L





x

x
R
L
E

Ae
sin(
n
x
/

t
)

Ae
sin(
n
x
/

t
)
z
R
L
Web Tutorial
http://www.enzim.hu/~szia/cddemo/edemo0.htm
• I. Basic concepts: Electromagnetic waves and types of polarization
• Plane-polarized wave: Horizontal
• Plane-polarized wave: Vertical
• Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  45º Plane
• Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  Right circular
• Superposition of plane-polarized waves: Horizontal + Vertical  Left circular
• Circularly polarized waves: Right and Left
• Superposition of circularly polarized waves: Right + Left circular  Plane!
• II. Interaction of light and matter
• Plane-polarized wave: Absorption
• Circularly polarized wave: Absorption
• Plane-polarized wave: Refraction
• Circularly polarized wave: Refraction
• Circular dichroism
• Circular birefringence
• Circular dichroism AND birefringence
EMANIM
• http://www.enzim.hu/~szia/emanim
• Public domain software
• Source code and Windows binary
available
• In English and Hungarian
Estructura secundaria
A. Triosafosfato isomerasa (H:0.52, S:0.14, T:0.11, O:0.23)
B. Lisozima (H:0.36, S:0.09, T:0.32, O:0.23)
C. Mioglobina (H:0.78, S:0.0, T:0.12, O:0.10)
D. Quimotripsina (H:0.10, S:0.34, T:0.20, O:0.36)
Cambios conformacionales
-18
A
-20
1.2
B
220(millidegrees)
1.0
0.8
-22
fD
0.6
-24
0.4
-26
0.2
0.0
-28
20
30
40
50
T( C)
60
70
-0.2
20
30
40
50
T( C)
60
70