Transcript Clase_DNA_1_VR - Genética Molecular

Genética Molecular 2010
e-mail: [email protected]
clave: cromatina
Profesores: Dr. Víctor Romanowski
Dr. Daniel Grasso
Instructoras: Dra. Silvina Richard
Dra. Patricia Agostino
“Dogma central de la biología molecular”
replicación de DNA
DNA
reparación
recombinación
transcripción
inversa
transcripción
virus a DNA
retrovirus y
retroelementos
procesamiento de RNA
splicing, edición, modificación de
nucleótidos y de extremos 5´y 3´
RNA
transcripción y
replicación de RNA
virus a RNA
traducción
proteína
plegamiento (folding),
procesamiento,
direccionamiento (targeting)
Víctor Romanowski
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Las primeras evidencias
1928: Frederick Griffith
Infección con dos cepas de
Streptococcus pneumoniae
Lisas (S): virulentas
Rugosas (R): inofensivas
(S)
(R)
(S) inactivada
Griffith showed that adding heat-killed
virulent bacteria (harmless to mice) to
a live nonvirulent strain permanently
transformed the latter into lethal,
virulent, encapsulated bacteria.
(R) + (S) inactivada
El principio de transformación observado
por Griffith era el DNA de la bacteria de la
cepa S (virulenta).
Si bien la bacteria había muerto, su DNA
sobrevivió al proceso de alta temperatura
y fue tomado por la bacteria R
(inofensiva).
EL DNA de la cepa S contiene los genes
que forman la cápsula de protección de
polisacárido. Equipado con este gen, la
cepa de bacteria R estaba ahora provista
de protección frente al sistema inmune
del animal y por lo tanto podía matar al
animal.
La naturaleza exacta del principio de
transformación de DNA fue verificada en
los experimentos realizados por Avery,
McLeod y McCarty, y por Hershey y Chase.
¿Como se demostró que el DNA
es el responsable de la herencia?
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M.
(1944) fue la primer evidencia directa de que el DNA
es la base de la información genética
Extract from heated smooth (S) bacteria
Extract from heated smooth (S) bacteria
treatment with DNase (digests DNA)
treatment with protease (digests proteins)
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mice lived
mice died
DNA carries genetic information
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Alfred Hershey y Martha Chase (1952)
Determinaron que el DNA
es el material genético
en el bacteriófago T2
32P
experiment
35S
experiment
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La naturaleza química de los ácidos nucleicos
Cuando se realiza la hidrólisis
completa de los ácidos nucleicos,
se obtienen tres tipos de
componentes principales:
•Azúcar: una pentosa.
•Ácido fosfórico
•Bases nitrogenadas:
purinas y pirimidinas
Cómposición química de los
Ácidos nucleicos
Bases nitrogenadas: púricas y
pirimidínicas.
A, G, T, C están presentes en el ADN
A, G, U, C están presentes en el ARN
Cómposición química de los
Ácidos nucleicos
Terminología:
bases/ nucleósidos/ nucleótidos
Los nucleótidos se unen entre sí para formar largas cadenas de polinucleótidos,
esta unión entre monómeros nucleótidos se realiza mediante enlaces fosfodiéster
entre los carbonos de las posiciones 3’ de un nucleótido con la 5’ del siguiente
ADN =
DNA
ARN =
RNA
Conformación de un nucleótido:
ángulos de torsión
Grados de libertad
Restricciones
estéricas
Conformaciones adoptadas por los
nucleósidos de purina y pirimidina
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del DNA
REGLAS DE CHARGAFF
(1940)
La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T).
%A = %T
La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C).
%G = %C
La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma especie.
La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas (T+C).
(A+G) = (T + C)
La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo, pudiendo
tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.
La composición de bases varía de una especie a otra.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
% de bases en
distintos
organismos
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del DNA
Patrón de difracción de rayos X
Patrón helicoidal del DNA. (1953)
Dos periodicidades a lo largo del eje, una primaria
de 3,4 Å y una secundaria de 34 Å.
"The instant I saw the picture my mouth fell open and my
pulse began to race." -- James D. Watson (1968), The Double
Helix, page 167. New York: Atheneum, Library of Congress
card number 68-16217.
Avances científicos
Molecular Structure of Nucleic Acids:
A Structure for Deoxyribose Nucleic Acid
James Watson & Francis Crick
Nature, vol 171 (4356), 737-738
25 de abril de 1953
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructura del DNA: la doble hélice
• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa
alternantes está expuesto al agua del ambiente
• El anillo de furanosa está en
la conformación C-2´endo
• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice,
con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice
• En el equilibrio ceto-enol, las formas tautoméricas
predominates de las bases son las ceto
•(ceto : enol = 10.000 : 1)
• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la
superficie de la doble hélice
G
C
A
T
Reglas de Chargraff: DNA doble cadena (dsDNA)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del dsDNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
interacciones que estabilizan la doble hélice
• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribución)
• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica
• Interacciones iónicas:
- Repulsión
entre las cargas negativas de los fosfatos
- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el dsDNA
(cationes divalentes más eficientes que monovalentes;
el Mg+2 estabiliza la estructura del RNA)
ver estructuras secundarias en rRNA, por ejemplo...
DNA A: 75% agua
(esporos), Na+
DNA B: 92% agua
Watson & Crick
DNA Z:
poli-pur-pyr, -GCGC…
alta [Na+]
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Comparación de las formas A, B y Z del DNA
La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructuras inusuales
Palíndromos
(palindromes)
Repeticiones en espejo (mirror repeats)
Horquilla
(hairpin-loop)
Cruciforme
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructuras inusuales: triplex DNAs
Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar
puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.
H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos
cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una
doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en
cromosomas eucarióticos.
Apareamiento tipo Hoogsteen
Estables a pH bajos (citosina protonada, C+)
H-DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructuras inusuales: cuadruplex DNA
DNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas
mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen
Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura
especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas
veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico
serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.
Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G):
5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
Las moléculas de ssRNA pueden
exhibir conformaciones variadas
Estructuras secundarias en RNA
tRNA
Propiedades fisicoquímicas
de los ácidos nucleicos
• H+ y HO• Espectro UV
• Temperatura de desnaturalización
•
(estabilidad de la doble hélice a medida que se incrementa la temperatura)
• Densidad de flotación
•
(ultracentrifugación en gradientes de densidad)
Hidrólisis en medio ácido
Ácidos fuertes : escinden tanto los enlaces
fosfodiéster como los enlaces N-glicosídicos.
Ácidos débiles : escinden los enlaces N-glicosídicos.
Los enlaces de las purinas son más lábiles que de
las pirimidinas
dsDNA en medio alcalino fuerte
desprotonación de los
>N-H de los heterociclos
¿...?
Hidrólisis en medio alcalino
RNA
Desnaturalización del ADN
Desnaturalización térmica
TEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm (melting temperature)
Propiedades ópticas de los
nucleótidos
Efecto hipercrómico
ssDNA
(desnaturalizado a 90 oC))
dsDNA
(nativo a 28 oC)
The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately
260 nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking
interactions. When DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in
absorbance is seen. This change is called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be
monitored as a function of temperature
Desnaturalización térmica
TEMPERATURA DE FUSIÓN = Tm (melting temperature)
medida de
A260nm
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Desnaturalización del DNA
Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo
es denominada Tm (temperatura de melting)
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4
Cálculo de Tm
•Oligonucleótidos largos:
Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N)
(N=longitud del oligo)
DESNATURALIZACION POR CALOR
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Parámetros que intervienen en la desnaturalización del DNA
Parámetro
Composición de
bases
Efecto sobre Tm
Efecto sobre la velocidad de
renaturalización
Incremento de Tm con el
aumento del %G-C
No ejerce efecto
<150 bp; incremento de
Tm con el incremento de
longitud; >500 bp no hay
efecto
Se incrementa la velocidad con la longitud
Fuerza iónica
Incremento de Tm con el
aumento de [Na+]
Optimo a 1.5 M Na+
%bp mismatch
Disminuye Tm con el
aumento de % mismatch
Disminuye la velocidad con el aumento de
% mismatch
Concentración
No ejerce efecto
Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]
disminuye Tm con el
aumento de
[formamide], [urea]
Optimo a 50% formamide
Longitud
Agentes
denaturalizantes
Temperatura
-
Optima a 20°C por debajo de Tm
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Densidad de flotación de los ácidos nucleicos
Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada por
ultracentrifugación a equilibrio en un gradiente de densidad.
A mayor contenido en G+C, mayor densidad.
DNA
Densidad (g/cm3)
% (G+C)
Polímero A-T
1.675
0
Diplococcus pneumoniae
1.700
42
Escherichia coli
1.710
51
Serratia marcescens
1.716
55
Mycobacterium phlei
1.732
73
Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su
composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la
densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:
 = 1,660 + 0,00098(G+C)
Avances científicos
• Disociación y reasociación de las hebras
complementarias del DNA (hibridación de sondas o
cómo encontrar una aguja en un pajar)
• Replicación del DNA in vitro (síntesis de genes
usando cada una de las hebras de la doble hélice como
molde para la copia)
• PCR: amplificación de un segmento de DNA en un
tubo de ensayo (cómo leer información a partir de una
sola célula, cómo detectar un virus en una muestra de
sangre, etc.)
• Síntesis de DNA a partir de RNA (transcriptasa reversa
de retrovirus)
Avances científicos
• Enzimas de restricción (tijeras mágicas para cortar
DNA en forma precisa)
• Ligasa (pegamento especial para unir trozos de DNA:
permite la construcción de moléculas recombinantes)
• Enzimas de restricción + ligasa =
DNA recombinante (ingeniería genética)
Agentes intercalantes
Naranja de acridina
Bromuro de etidio
•
•
•
•
Moléculas aromáticas que se intercalan en el ADN entre bases apiladas
Fluorescentes
Detección de DNA y RNA
Agentes mutagénicos
colorantes de ácidos nucleicos,
agentes intercalantes
Bromuro de etidio
Naranja de acridina
Hibridación
reasociación de secuencias
complementarias
secuencia blanco + sonda
DNA reassociation (renaturation)
Double-stranded DNA
Denatured,
single-stranded
DNA
k2
Slower, rate-limiting,
second-order process of
finding complementary
sequences to nucleate
base-pairing
Faster,
zippering
reaction to
form long
molecules
of doublestranded
DNA
Sondas
de ácidos nucleicos
Sonda
marcada
Acido nucleico
inmovilizado
Sondas
fluorescentes
Sondas con grupos detectables por
afinidad con anticuerpos (DIG) y otras
proteínas (avidina o estreptavidina)
High stringency:
condiciones estrictas de
hibridación y lavado de la
sonda, tales que solamente
se mantienen unidas las
secuencias blanco y sonda
que son 100%
complementarias
Low stringency: condiciones
de hibridación y lavado de la
sonda, tales que se
mantienen unidas las
secuencias blanco y sonda
entre las que no hay
complementariedad perfecta
(con “mismatches”)
PCR: the polymerase chain reaction
Figure 7-38
PCR
PCR
“Clonado” de un gen in vivo e in vitro
.
How to amplify an interesting gene.
Two methods are (a) in vivo, by
tricking the replication machinery of a
bacterium into amplifying recombinant
DNA containing the gene, and
(b) in vitro, in the test tube.
Both methods employ the basic
principles of molecular biology: the
ability of specific proteins to bind to
DNA (the proteins shown in yellow)
and the ability of complementary
single-stranded nucleic acid segments
to hybridize together (the primer used
in the test-tube method).
Tamaños de genomas
Tamaños de genomas
Virus a DNA
Escherichia coli genome: 4,639,221 bp
4,377 genes
4,290 of these genes encode proteins; the rest RNAs
1 Cell length 2 μm or 2x10-6 m
2 Cell diameter 0.8 μm or 0.8x10-6 m
3 Cell total volume 1x10-15 L
Tamaños de genomas
• Escherichia coli 1,5 µm
1 par de bases (pb)  0,34 nm = 0.34 x 10-9 m
1 molécula de DNA genómico: 4,6 106 pb / célula
DNA:
1,5 mm !!!
• Cromosoma y plásmidos
Longitud del DNA
de una célula humana
1 par de bases (bp)  0,34 nm = 0,34 x 10-9 m
2 juegos of 3,0 109 pb / célula
2 metros
!!!
Contenido de DNA (longitud total)
en un humano adulto
2 m/célula x 1014 células
2 x 1011 kilómetros
200.000 millones de km
perímetro: 4 x 104 km
distancia de la Tierra al Sol: 1,5 x 108 km
Longitud del DNA
de una célula humana
1 par de bases  0,34 nm = 0,34 x 10-9 m
2 juegos de 3,0 109 pares de bases / célula
2 metros
!!!
Tamaño del DNA de un adulto
2 metros/célula x 1014 células
2 x 1011 kilómetros
200 mil millones de kilómetros
circunferencia de la Tierra: 4 x 104 km
distancia de la Tierra al Sol: 1,5 x 108 km
Empaquetamiento del DNA eucariota
En el genoma humano tenemos 3
x 109 bp
distribuidos en 23 cromosomas
La forma B-DNA ocupa 0,34 nm/bp
La longitud total del DNA celular humano es de 2
metros!!!
Debemos empaquetarlo en un núcleo con un diámetro de
(> 10.000 veces)
5-6 mm
El DNA durante la interfase se encuentra condensado formando un complejo
nucleoproteico denominado cromatina
Próxima clase:
superenrollamiento y
empaquetamiento del DNA
Cinética de reasociación de
cadenas complementarias.
Relación con el tamaño del DNA
Bibliografía recomendada
•Biología Molecular de la Célula. Alberts B., Johnson A., Lewis
J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland
Publishing, Inc.
•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A.,
Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial
Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés).
•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall.
(y ediciones anteriores)
•Lehninger. Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M.
(2005), 4º edición.
(en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España)
•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial
McGraw-Hill.
Información actualizada y sitios de interés
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books