SENSORI & BIOSENSORI: Analisi dei Prodotti

Gianfranco Greppi Laboratorio di Bionanotecnologie.

Porto Conte Ricerche Università di Sassari

Sommario

  Ricerca e Trasferimento Perché i biosensori  La tecnolgia  Le applicazioni

Le Università costituiscono da sempre uno dei blocchi costituivi dei cosiddetti sistemi della ricerca e dell'innovazione

Università Enti pubblici e Non-profit Imprese con i propri laboratori

infrastrutture di base

RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro

OCSE

Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA’ +0,8

Un percorso per il trasferimento tecnologico nel settore delle Biotecnologie Relatore

:

GIANFRANCO GREPPI LEA BIOTECH SPINOFF UNIMI

Il sistema della ricerca, della sperimentazione e del trasferimento dell’innovazione Università Enti pubblici e Non-profit Imprese con i propri laboratori

infrastrutture di base

 Ogni istituzione può giocare

molteplici ruoli

: formazione, ricerca fondamentale e applicata, sviluppo tecnologico    -

i legami

tra gli attori del sistema si sono intensificati: le collaborazioni tra imprese, Enti e Università, non sono più eventi sporadici ma prassi comune; esse coinvolgono crescenti flussi di risorse finanziarie, di uomini e di conoscenze - la comparsa e l'affermazione del

sistema finanziario

come nuovo attore nei SI, con un ruolo del

Venture Capital -Start-up

nei settori di punta tecnologica, originate nelle Università e nei Centri di Eccellenza scientifica.

RECESSIONE E MANCATA RICERCA Nel 2003 investimenti in ricerca 16 miliardi Euro

OCSE

Francia 38 miliardi ULTIMO DEI PAESI DEL G7 Unico con oltre 50% finanziamento pubblico INVESTIMENTI IN CONOSCENZA 1,8 vs 4,5 Paesi OCSE PIA, POR, MIUR innovazione PRODUTTIVITA’ +0,8

T RASFERIMENTO SPIN-OFF SPIN-OFF APPLICATA

APPLICATA

RICERCA DI BASE RICERCA DI BASE DIDATTICA DIDATTICA

RECESSIONE E MANCATA RICERCA SPIN-OFF

APPLICATA

RICERCA DI BASE DIDATTICA

BIOTECH & PMI (2003) I m p r e s e b i o t e c n o l o g i c h e p e r s e t t o r e m e r c e o l o g i c o A m b i e n t e C h i m i c o A g r o a l i m e n t a r e C u r a d e l l a s a l u t e

0 12 11 22 10 20 30 40 50 58 60 70

Impiegano 1700 addetti e realizzano un fatturato di 250 milioni di euro.

BIOTECH & PMI (2003)

Tec nologie applic ate nelle impres e biotec nologic he in Italia B io info rmatica B io remediatio n 12 13 Cellule staminali Chimica co mbinato ria 5 10 Geno mica e pro teo mica A ntico rpi mo no clo nali Clo naggio in micro rganismi piante ed animali, DNA rico mbinante A cidi nucleici e so nde B io trasfo rmazio ni, enzimo lo gia e bio catalisi 14 22 22 23 24 Fermentazio ne, separazio ne dei pro do tti P CR 28 0 5 10 15 20 25 30 35 40 n° impres e 42 45

BIOTECH & PMI 1990 vs 2010

Vecchi valori BASSI COSTI HIGH THROUGHPUT Nuovi valori QUALITA’ DEI DATI INTEGRAZIONE STANDARDIZZAZIONE DECENTRALIZZAZIONE INFORMAZIONE CURVA APPRENDIMENTO ACCELERATA

BIOTECH & PMI 2006-2010

SCREENING NUOVI LEAD PROTEOMICA GENOMICA ARRAY

BIOTECH & PMI TREND

BIO-NANOTEC PER LA SALUTE E PER LA BIOSICUREZZA DEI PRODOTTI

BIOTECH & PMI TREND

BIOTECH & PMI PRODOTTI

PIATTAFORMA BIOTECH ANALISI BIOLOGICA

RICERCA ANALISI CHIMICA IDENTIFICA IL TARGET VALIDA IL TARGET IDENTIFICA IL LEAD OTTIMIZZA LEAD

SVILUPPO

TEST PRE-CLINICI TEST CLINICI

PROTEOMICA

Bioinformatica

FARMACOGENOMICA DRUG DELIVERY GENOMICA

Biotech & Fusion Technologies Genomics, Proteomics and Bioinformatics: Combinatorial –chemistry Peptide libraries- tea bags, beads Combinatorial –biology Directed evolution DNA Shuffling, Molecular Breeding High throughput analysis: Nucleic Acid based Sequencing Microarrays Protein based.

2-D, electrospray/nanospray MS: MALDI-TOF, LC/MS/MS, SELDI

Bioinformatica

Imaging/optical biology.

Biosensors, Bioelectronics Bionetworks (Nanotechnology).

MICROARRAY

PROTEOMICA

La conoscenza deve scorrere da quelli che sanno le cose a quelli che fanno cose

Joel Mokyr “Historical Origins of Knowledge Economy”Princeton University 2002

Perchè i biosensori?

 I biosensori sono degli strumenti analitici con

potenzialità enormi

, sia in termini di interesse scientifico, sia in termini di applicazioni commerciali: – – – – – – Capo medico diagnostico. Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque Analisi in remoto per contaminazioni batteriche nelle attività bioterrorismo. Analisi dei patogeni negli alimenti Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici negli alimenti

I biosensori

 I

BIOSENSORI

sono degli strumenti analitici costituiti da un componente biologico e un trasduttore.

trasduttore comp. biologico film protettivo PC

Schema logico di un sensore

Transducer Signal Unità di elaborazione Unità di memorizzazione Interfaccia elettronica

Perchè i biosensori?

 Analisi degli alimenti – Analisi dei pesticidi e contaminanti delle acque – – – – Analisi dei patogeni Analisi diossine Analisi di routine dell’acido flico, biotina, vitamina B12 e acido pantotenico Analisi di antibiotici

Cosa misura il biosensore?

 L’attività dell’enzima:

I trasduttori

Trasduttori usati per la costruzione di biosensori: I generazione

Trasduttori

Elettrochimici Ottici Acustici Amperometrici Potenziometrici II generazione III generazione Elettrodi a vetro Termici Conduttimetrici ISE ISFET

Trasduttori ottici

A

  log

I I

0

t

    

C

 Un biosensore a trasduttore ottico misura i cambio di assorbanza di uno strato di reagente biologico che interagisce con l’analita.

Risonanza di superficie a plasmon

 SPR

Trasduttori acustici



f

 

k

(eq.

di Sauebrey)

Trasduttori potenziometrici

 pHmetro: – – Glucosio ossidasi  glucose + O 2  gluconolactone + H 2 O 2  gluconate + H + Lipasi  lipide neutro + H 2 O  glicerolo + acidi grassi + H +

E



E

0 

RT nF

ln

a i

(eq.

di Nernst)

Trasduttori potenziometrici

 ISE al NH 4 + : – L-amino ossidasi  L-amino acido + O 2 + H 2 O  keto acido + NH 4 + + H 2 O 2 – asparaginasi  L-asparagine + H 2 O  L-aspartate + NH 4 +

E



E

0 

RT nF

ln

a i

(eq.

di Nernst)

Trasduttori potenziometrici

 ISE al I :  – perossidasi  H 2 O 2 + 2H + + 2I  I 2 + 2H 2 O ISE al CN : – glucosidasi  amigdalina + 2H 2 O  2glucose + benzaldeide + H + + CN -

E



E

0 

RT nF

ln

a i

(eq.

di Nernst)

Trasduttori conduttimetrici

Enzima Lamina d’oro o di platino  Il prodotto di una reazione enzimatica cambia la conducibilità della soluzione in prossimità degli elettrodi.

Trasduttori amperometrici

 L’amperometria misura una corrente ad un potenziale applicato costante.

Add 10

m

M steady-state Add 10

m

M steady-state i



nFAD



C



x

(eq.

di Nernst Plank)

background

Time

Amperometria

Corrente e potenziale

 Su un metallo inerte, applico un potenziale anodico, o catodico, relativamente ad un elettrodo di riferimento.  Il metallo misura una corrente anodica o catodica, in base al numero delle specie in soluzione che si possono ossidare o ridurre.

Potenziale anodico e catodico

e +++++ Potenziale anodico: La superficie è povera di elettroni.

Una specie chimica capace di donare elettroni verrà ossidata e -------- Potenziale catodico: La superficie è ricca di elettroni.

Una specie chimica capace di ricevere elettroni verrà ridotta

Biosensori amperometrici

Substrato ox Substrato red H 2 O 2 O 2 Working electrode

elettroni

Biosensori amperometrici

 Si classificano in I, II e III generazione

Biosensori della I generazione

 La prima classe di biosensori amperometrici riguarda la misura diretta del prodotto della reazione enzimatica: – – – Perossido di idrogeno NADH Consumo del cofattore (ossigeno) H 2 O 2 O 2

Biosensori della I generazione

 Il primo biosensore fu ideato da Clark nel 1962. Esso si basava sulla misura dell’ossigeno consumato durante la reazione enzimatica di un ossidasi, tramite un elettrodo di platino polarizzato a -700 mV, seguendo la reazione:

O

2  4

H

  4

e

  2

H

2

O

 Il range dinamico di questo dispositivo è circa tra 50 m M e 1 mM.

Biosensori della I generazione

 Un’alternativa al primo biosensore si basa: – sulla imobilizzazione dell’enzima direttamente sulla superficie dell’elettrodo – sulla misura del perossido di idrogeno prodotto durante la reazione enzimatica, tramite un elettrodo di platino polarizzato a +700 mV, seguendo la reazione:

H

2

O

2  2

H

 

O

2  2

e



Biosensori della I generazione

 Il perossido di idrogeno può anche venire ridotto all’elettrodo di platino, secondo la seguente equazione:

H

2

O

2  2

H

  2

e

  2

H

2

O

Biosensori della I generazione

 Alternativamente, è possibile misurare la produzione di NADH da NAD+ quando si usano enzimi tipo deidrogenasi:

NADH



NAD

 

H

  2

e

  Il NADH è ossidato all’elettrodo, ma sono richiesti potenziali molto alti.

Biosensori II generazione

 I biosensori si sono evoluti, sostituendo il cofattore naturale dell’enzima con una molecola capace di traghettare gli elettroni dal centro attivo dell’enzima alla superficie del trasduttore amperometrico.

Substrato ox Mediatore red Working electrode

elettroni

Substrato red Mediatore ox

Cos’è un mediatore?

 I mediatori si possono classificare in: – Molecole organiche – – – Complessi organici di metalli di transizione Molecole inorganiche Polimeri conduttori  Idealmente, il mediatore dovrebbe essere piccolo da entrare facilmente nel sito attivo dell’enzima, essere riciclabile, scambiare elettroni velocemente con l’elettrodo.

Cos’è un mediatore?

Cos’è un mediatore?

 Per un processo reversibile:

i p i pa

 

i pc

2 .

69 1  10 5

n

3 / 2

AD

1 / 2

Cv

1 / 2

E pa



E pc

 0 .

059 /

n E

0 ' 

E pa



E pc

2

Biosensori II generazione

  Ulteriori sviluppi nell’utilizzo dei biosensori della II generazione riguardano l’impiego di polimeri conduttori: – Polipirrolo – Polianilina – Politiofene Questi polimeri hanno la capicità di formare film conduttivi, che possono essere impiegati per immobilizzare enzimi e mediatori di vario tipo.

Biosensori II generazione

polianilina polipirrolo politiofene Il premio nobel per la Chimica nel 2000 fu attribuito a Alan J. Heeger, Alan G MacDiarmid, e Hideki Shirakawa per il loro lavoro sui polimeri conduttori.

Biosensori III generazione

Componenti bioattivi

COMP. BIOATTIVI Enzimi

biocatalitici

Cellule

biorecettori

Acidi Nucleici Anticorpi microrganismi tessuti

Biotecnologia Applicata: Analisi dei Prodotti Vegetali

AA 2007 - 2008 Lezione 7

r g y e n e no enzyme present enzyme present reactant 1 + reactant 2 + enzyme Intermediate : enzyme/reactant 1 + reactant 2 Course of reaction products + enzyme Replay Close window

Fattori che influenzano l’attività

Tecniche di immobilizzazione

Fisica Chimica assorbimento fisico ritenzione incorporazione polimerizzazione Legame covalente

su gel su membrane pasta di carbone inchiostri polimeri conduttori sull’elettrodo su membrana