Transcript 醣蛋白
胺基酸以胜肽鍵連接而成一條長線性的胜肽鏈 (peptide chain)。蛋白質是由一條或多條胜肽 鏈所組合而成 。 在體內蛋白質的功能: 催化反應 作為細胞建構材料 典型蛋白質 一、醣蛋白 二、脂蛋白 三、膠原蛋白 四、免疫球蛋白 一、醣蛋白 (一) 結 構 醣蛋白(glycoproteins)是糖與蛋白質的複 合物。 黏蛋白(mucoprotein): 含糖量多者(4%以上),稱黏蛋白。 含糖量少者(4%以下),稱醣蛋白。 又稱蛋白聚糖(proteoglycan)，醣基部分 為醣胺聚醣(glycosaminoglycan)，是一種 長而不分支的多醣鏈，含有許多酸性基團， 大多具有黏性， 故稱為黏多醣(muco-polysaccharide)。 黏蛋白廣泛地存在於哺乳動物各種組織中，其 中尤以結締組織含量最為豐富，是細胞間隙的 主要成分。 @@ 血型蛋白亦是醣蛋白的一種，含糖量多達85%。 血型蛋白亦是醣蛋白的一種 • Three related oligosaccharide components of certain glycoprotein and glycolipids are expressed on the surfaces of human red blood cells. 血型蛋白亦是醣蛋白的一種 • All human have the enzymes for synthesizing O antigen. • Persons with type A blood also have a glycosyltransferase enzyme N-acetylgalactosamine •Persons with type B blood also have a transferase enzyme that adds galactose to O antigen • AB blood types: both A B transferase 醣蛋白的種類 醣蛋白中糖的種類只有十來種， 六碳糖（hexose，又稱為己糖）， 五碳糖（pentose，又稱為戊糖），包括D-半乳糖 (galactose)、D-甘露糖(mannose)、D-葡萄糖(glucose)、D-木 糖(xylose)、L-阿拉伯糖(arabinose)、L-岩藻糖(fucose)、N乙醯葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)、N-乙醯半乳糖胺(Nacetylgalactosamine)和唾液酸（sialic acid，又稱為N-乙醯神 經胺酸）等。 糖苷鍵連接方式大多為O酯鍵， 少數為N胜肽鍵 （如圖5-1）。 醣蛋白的種類 動物、植物、病毒和微生物都具有醣蛋白。 蛋白質在抹種動物中是以醣蛋白形式表現 但在另一種動物中卻不一定。 即使同為醣蛋白，但所含的醣成分與含量 也會不同。 ex: 牛、綿羊、豬、大鼠的核糖酸酶(ribonuclease) 都是醣蛋白，但含醣量分別是 9.4%、9.8%、38%、0 %。 (三) 功 能 醣蛋白中扮演不同的生物功能。 病毒外膜所含有的表面醣蛋白與其對寄主 的吸附作用有關 酵母菌和植物細胞壁的醣蛋白則是一種結 構成分 在高等動物中上皮細胞(epithelial cell)所分泌 的醣蛋白具有保護和潤滑作用 血液中的許多醣蛋白擔負著運輸、血液凝固 和免疫等功能。 ex: 免疫球蛋白抗原、血型抗原、組織相容抗原 二、脂蛋白 (一) 結 構 脂蛋白(lipoproteins)是由脂質和蛋白質結合而成。共價性 結合，則至少有三種方式： 1.酯鍵: 脂肪酸的COOH與胺基酸的OH結合 2.醯胺鍵:脂肪酸的COOH與胺基酸的NH2結合 + R N 3.硫醚鍵: 雙醯甘油（Diacylglycerol）上 的OH與Cysteine的-SH結合成 硫醚鍵（Thioether bound） + H 二、脂蛋白 脂蛋白中的蛋白質部分稱為脫輔基蛋白(apoprotein)， 脫輔基蛋白富含厭水性胺基酸區域，易於與脂質結合。 R N H 厭水性的胺基酸 脂蛋白的apoprotein 可調節特定脂質在細胞的進出； 脂蛋白脂質的部分包含磷脂質（phospholipid）、 三醯甘油(triacylglycerol)以及膽固醇（cholesterol）。 B-100 血漿脂蛋白是存在於動物血液中的一類可溶性脂蛋白， 可溶解於血漿中。脂蛋白的主要功能是運輸脂肪族及固醇類脂質。 根據密度大小，血漿脂蛋白可分為幾種不同類型： 1.乳糜微粒(chylomicron, CM)：含脂質99%以上，以 三醯甘油(triacylglyceride)最多，蛋白質含0.2~0.5%。 Apoprotein以A1、A2 、 A4為主，由小腸細胞合成。 腸壁細胞吸收的脂質，先合成脂肪，再與apoprotein 形成CM 脂肪來自於食物，所以CM的功能是運送外源性的脂 肪 2.極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)：含蛋白質5~10%、脂質 約90%。 3.低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)：含蛋白 根據蛋白質密度大小，血漿脂蛋白可分為幾種不同類型： 1.乳糜微粒(chylomicron, CM)：含脂質99%以上，以 三醯甘油(triacylglyceride)最多，蛋白質含0.2~0.5%。 Apoprotein以A1、A2 、 A4為主，由小腸細胞合成。 腸壁細胞吸收的脂質，先合成脂肪，再與apoprotein形 成CM 脂肪來自於食物，所以CM的功能是運送外源性的脂肪 2.極低密度脂蛋白(very low density lipoprotein, VLDL)： 含蛋白質5~10%、脂質約90% ，以三醯甘油 (triacylglyceride)最多。 Apoprotein以B-100、C 、 E為主，由肝臟細胞合成。 脂肪來自於糖或儲存性的脂質，VLDL是運送內源性的 脂肪 3.低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)：含蛋白質 25%、脂質75%。 Apoprotein以B-100、E為主。 LDL經由脂蛋白解脂酶 （lipoprotein lipase）和蛋白酶 水解掉部分的脂質和蛋白質後形成，使血液中的膽固醇與 磷脂比例升高。 LDL的功能是將肝內的膽固醇送到肝外。 4. 高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL)：所含蛋 白質和脂質大約各佔一半。 脂質內以膽固醇與磷脂為主。 Apoprotein以B-100為主，由肝細胞合成。 功能是將肝外組織的膽固醇及磷脂運輸入肝內。 專門運送三醯甘油脂 （triacylglyceride） B-100 專門運送膽固醇（cholesterol） 以及磷脂（phospholipid） 5. 極高密度脂蛋白(very high density lipoprotein, VHDL)：蛋白質佔99%，脂質佔1%。 脂質為游離的脂肪酸 Apoprotein以A1、A2為主。 功能是運輸游離脂肪酸。 6. 中低密度脂蛋白（intermidiate density lipoprotein, IDL）: IDL是VLDL被lipase水解成LDL的中間產物。 VLDL and LDL increase the risk of coronary heart disease; HDL appears to protect against it . HDL可將肝外的膽固醇及磷脂運輸入肝內代謝掉 三、膠原蛋白 所有多細胞生物都含有膠原蛋白(collagen)，是哺乳動物 最為豐富的一種蛋白質，約佔其總量的25%， 是皮膚、 軟骨、動脈血管以及結締組織的主要成分。 (一) 膠原蛋白的胺基酸組成和排列 以每三個胺基酸為一個重複單位，X-Pro-Gly 或X-HypGly，X可以是任一種胺基酸，但通常是Pro或Hyp，第三 個胺基酸總是甘胺酸（Gly），因為膠原是一種三股螺 旋結構，每個重複單位的第三個殘基剛好位於螺旋內， 只有甘胺酸能小到位於螺旋內。其他兩個殘基的R基處 於螺旋的外部（圖5-2）。 膠原蛋白的基本結構單位 膠原蛋白基本結構單位稱為原膠原(tropocollagen)。原膠 原分子定向排列整齊，分子之間通過共價交聯，形成穩 定的膠原微纖維，再由許多微纖維聚集成膠原蛋白。 Tropocollagen每隔64～70nm距離就有易於染色的極性部 位存在，而在膠原微纖維中又是以階梯式定向排列， 所以在染色的膠原蛋白上可以看到較深的橫紋 膠原蛋白由三條peptide chain組成，每條約有1000 amino acids。 Peptide chain 之間由氫鍵聯繫，由Gly的NH與另一條Gly的CO形成。 四、免疫球蛋白 當生物受到外來抗原(antigen)的刺激而產生抗體 (antibody)，抗體與抗原會進行免疫反應，故又稱 抗體為免疫球蛋白(immunoglobulin)。 (一) 免疫球蛋白的生成 免疫球蛋白是由漿細胞(plasma cell)產生的，而 漿細胞由淋巴細胞(lymphocyte)轉變而來。淋巴 細胞有兩大類：T淋巴細胞和B淋巴細胞，這兩 類淋巴細胞均起源於骨髓。 T細胞： 在發育時受到胸腺(thymus)的控制，轉 變成胸腺依賴性淋巴細胞。 負責細胞性免疫(cellular immunity)作用 B細胞： 細胞在鳥類受到法氏囊(Bursa Fabricii) 所控制，轉變成囊依賴性淋巴細胞(dependence of lymphocyte on bursa)。 負責體液性免疫(humoral immunity)作用。 (二) 種類與結構 每一個免疫球蛋白分子由四條胜肽鏈所構成， 兩條相同的長鏈稱重鏈或H鏈(heavy chain)， 兩條相同的短鏈稱輕鏈或L鏈(light chain)。各 鏈間透過雙硫鍵連接成一個Y字形。 V區 V區 C區 無論重鏈或輕鏈，都各有兩個特化 的區域： 可變區（variable region，V區） 恆定區（constant region，C區） 根據重鏈(heavy chain)恆定區（C區）結構的不同， 以及物理化學性質和免疫學特性的不同，將Ig分 為五類： IgG、IgA、IgM、IgD、IgE （依據正常人血漿濃度遞減順序）。 κ /λ 根據輕鏈（light chain） 恆定區（C區）抗原特異性的不同 ，則可分為κ(kappa)和λ(lambda) 兩型。 Ig分為五類 可變區內有高度可變區 （heavy variable region） 幾乎所有序列變化都發生在此區 κ /λ 各種抗體的特異性都取決於 H chain and L chain的高度可變區 Ig分為五類 蛋白質結構與功能 一、鐮刀形紅血球貧血症 鐮刀形紅血球貧血症(sickle cell anemia)即因病人在缺氧時 紅血球變為鐮刀狀而得名。 和正常人的血紅蛋白(HbA)相比，鐮刀形貧血症病人血紅 蛋白(Hbs)在鏈第六位的麩胺酸（Glutamic acid;Glu;E）被纈 胺酸(Valine;Val;V)所取代，這種"病變的"血紅蛋白在紅血球 表面聚集時，降低了細胞膜的穩定性，使得紅血球變成 彎月狀（鐮刀形），攜帶氧的能力也大大降低，導致貧 血的現象。 蛋白質與細胞癌 膀胱癌細胞中P21蛋白與正常細胞比較， 僅有一個胺基酸的差異， amino acid 12 Gly (正常細胞) Val （癌細胞） 由此可見，蛋白質一級結構中，胺基酸的改變 通常會使蛋白質的功能發生變化。 胺基酸維繫蛋白結構以及蛋白功能的發揮與作用 二、蛋白質酵素的活化 有一些蛋白質在細胞內剛合成時並無活性，它必須按特 定程式產生斷裂才會具有活性，這個過程叫做活化 (activation)。 例如: 負責血液凝固的纖維蛋白原和凝血酶原 消化作用的蛋白水解酶原 都需要被活化後才有作用 (一) 凝血與溶血作用 在血液中存在與血液凝固有關的兩個系統: 凝血系統 溶血系統 這兩套系統是由多種蛋白質的活化系統來實現的。 血液凝固過程有兩個主要環節: 血漿中的凝血酶原(prothrombin)受到血小板(platelet)中 一些因子的活化（ex: Ca2+）而形成凝血酶(thrombin) 血漿中的纖維蛋白原(fibrinogen)在凝血酶(thrombin)活 化下轉變成不溶性纖維蛋白(fibrin)網狀結構，使血液變 為凝膠狀，使血液在創傷處不致外流，產生保護作用。 血液溶血過程 纖維蛋白溶解酶原(profibrinolysin)，它被活化後轉變成 纖維蛋白溶解酶(fibrinolysin)，可將纖維蛋白溶解。 Ca2+ (二) 胰島素原的活化(Proinsulin Activation) 胰島素(insulin)含有A、B兩條鏈， 它的前驅物(precursor)—胰島素原(proinsulin)卻是單一條胜 肽鏈。 胰島素原(proinsulin)在體內被 類胰蛋白酶(tryptic analogue) 活化，切去C胜肽後轉變成有 活性的胰島素（圖5-4）。 (三) 異位調節作用 一些蛋白質利用其主體結構的改變來調節其生物活性， 使蛋白質能配合生理環境的需求發揮其功效，完成複 雜的生物機能，稱之為異位作用。例如：血紅素 血紅素具有兩種立體結構，其中一種對氧的親和力很高 (R state)，另一種對氧的親和力則相對較低(T state)。 當血紅素的一個次單元與氧結合後，使整個分子立體結 構隨之改變，對氧的親和力也急劇增加，這種 現象稱為異位作用 (allosterism) 三、蛋白質的變性 蛋白質在某些外在因子影響下，可引起其物理化學性質 的改變，乃至喪失生物功能，稱之為蛋白質變性。 蛋白質的變性來自於外在因子破壞了維繫蛋白質高級結 構的化學鍵，從而影響蛋白質的生理功能，不同的變性 因素對蛋白質高級結構的影響機制不盡相同。 1. 溫度：加熱使蛋白質變性稱為熱變性 (thermal denaturation)。多數熱變性是不可 逆性。 溫度升高，破壞氫鍵與雙硫鍵，蛋白質會因而發生 凝集（agglutination）而沈澱 (precipitation) 2. 尿素和胍(urea and guanido)： 尿素和鹽酸胍是常用的蛋白質變性劑。二 者的結構如下： 6M以上的鹽酸胍可使多數蛋白質分子由緊縮的 立體結構變得鬆散、四級結構解離成次單元，發 生凝集和沉澱。 3.表面活性劑(surface-active agent)：表面活性 劑通常是同時具有厭水性與親水性基團的兩性 分子(amphipathic)，例如常用作蛋白質變性 劑的十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate, SDS) 、Triton X -100 Proteins can be removed from membranes by detergents or high-salt solutions hydrophilic hydrophilic hydrophobic hydrophilic hydrophobic hydrophilic hydrophobic hydrophobic SDS為一種陰離子表面活性劑，即使在很低的濃 度下，也能與蛋白質高度結合。 SDS的非極性部分(hydrophobic)與蛋白質分子內 部的厭水基團相互作用，而硫酸根與蛋白質分子 表面的親水基團或水分子作用，致使蛋白質分子 立體結構發生很大變化： 寡聚體解離成次單元； 分子（或次單元）由球狀變為細桿狀 螺旋度大大增加，結構鬆散。 Proteins can be removed from membranes by detergents or high-salt solutions (臨界微細胞濃度) 4.有機溶劑(organic solvent)：有機溶劑可以影 響靜電力、氫鍵和厭水作用，從而導致蛋白質 的立體結構變化。 蛋白質性質的測定 一、分子量的推測 (一) 分析化學法 定量測定蛋白質中某一特殊元素的含量，可以測 得蛋白質的最低分子量。 化學方法測得的蛋白質的最低分子量只有和別的 物理化學方法配合使用時，才能得出真實的分子 量。 但是，根據最低分子量算出的真實分子量是比較 精確的。 例如： 用化學分析方法測得血紅蛋白中的含鐵量為0.34%, 則血紅蛋白的最低分子量為： 血紅蛋白 X 0.34/100 = 55.84 (鐵原子的分子量) ？ 血紅蛋白 ？ = 55.84 X 100/0.34 = 16700 但用其他方法測得血紅蛋白分子量為67000，為16700的 4倍，表示血紅蛋白部只含有一個鐵原子，而是含有 四個鐵原子 化學方法測得的蛋白質的最低分子量只有和別的物理化學方法 配合使用時，才能得出真實的分子量。 (二) 超高速離心法(Ultracentrifugation) 利用離心力作用可將懸浮溶液中的各種成分加以分離。 沉降作用(sedimentation)：如果在液體中懸浮的質點，其 比重大於液體的比重時，就會因重力作用而移向容器底 端，稱之為沉降作用(sedimentation)。沉降的速度與質點 的大小成正比。 擴散作用(diffusion)：由高濃度向低濃度運動，這是抗拒 沉降的力量。 (二) 超高速離心法(Ultracentrifugation) 擴散作用與沉降作用的方向相反，較小質點的擴 散速度較大，沉降速度則較小；較大的質點（如 蛋白質顆粒）則相反。 對於一個純化的蛋白質，在強大的離心力下，根 據它的沉降時間即可測定它的分子量。 (二) 超高速離心法(Ultracentrifugation) 在離心場中，蛋白質分子所受到的淨離心力 （離心力減去浮力）與溶劑的摩擦阻力平衡 時，單位離心力場下的沉降速度為一定值， 稱為沉降常數或沉降係數(sedimentation coefficient)： (二) 超高速離心法(Ultracentrifugation) 沉降係數 離心速度 加速度 式中：x為離心介面與轉子中心之間的距離 （釐米）；t是離心時間（秒）；dx/dt為離心 速度；為轉頭的角速度（孤度‧秒CC1）； 2x即相當於離心力場下的加速度。 因為速度÷加速度＝時間（或速度＝加速度×時 間），所以沉降係數的單位為秒。 分子量 8.31X107 耳格/（莫耳.度） 溶劑密度 D：擴散係數 蛋白質在水中的偏比容是0.74 ml/g 用超高速離心法測得的一些蛋白質的分子量見（表5-1） 沉降係數越大，分子量越大 二、沉澱作用 天然蛋白質溶液是穩定的親水膠體狀態，這種穩定性 乃由兩個因素所決定： 其一為水化作用(hydration)。 蛋白質表面分佈著R chain，會與水分子作用，在 蛋白質分子表面形成水化膜，對蛋白質具有保護作用， 避免分子間碰撞而聚集 其二為電荷排斥作用(charge repel)。 蛋白質為兩性離子 ，在酸性溶液中帶正電，在鹼 性溶液中帶負電。 在一定的PH值中，同種蛋白質帶相同電荷，所以 同性電荷相斥，蛋白質顆粒不聚集成大顆粒 蛋白質的穩定性對於生物有機體來說是必要的， 當其改變條件時，這種穩定性就會被破壞，使 蛋白質從溶液中沉澱出來。 沉澱蛋白質的方法有很多種，主要就是破壞水 化膜和電荷效應這兩個穩定因子。 1.中性鹽溶液：中性鹽對蛋白質的溶解度有雙 重影響 低濃度的中性鹽可以提高蛋白質的溶解度，這種現象 稱為鹽溶作用(saltingin) 高濃度的中性鹽則降低蛋白質的溶解度，可使蛋白質 沉澱，稱為鹽析作用 (salting-out)。 中性鹽溶液 中性鹽溶液是強極性物質： 與蛋白質外的水分子結合，破壞水化膜 中性鹽溶液是強電解質： 完全解離成帶電離子（如：NH4+ , SO42-） 破壞蛋白質表面電荷，蛋白質分子因碰撞 而聚集沈澱 不同濃度的中性鹽來分別沉澱各種不同蛋白質， 這種方法謂之分段鹽析(fractional salting-out)。 用鹽析法製備蛋白質，一般不會破壞蛋白質的 生物活性。 2.有機溶劑：由於有機溶劑往往能使蛋白質變性 失去活性，因此宜用稀濃度的有機溶劑，並要 攪拌均勻，在低溫下操作。 3.重金屬鹽類：當pH值大於蛋白質的等電點時， 蛋白質分子帶負電荷，此時加入Ag＋、Hg2＋、 Pb2＋等重金屬時，即可與蛋白質結合成不溶性 的鹽。 4.酸性試劑：使溶液pH值小於蛋白質的等電點， 蛋白質分子淨電荷為正，進而與試劑結合生成 不溶性沉澱。 ！ 用重金屬和酸性試劑沉澱的蛋白質往往失去活 性，而不能用於製備活性蛋白。 三、胺基酸的組成與序列分析 (一) 預處理 在進行胺基酸序列分析前，必須先行除去胜肽鏈 間或鏈內的氫鍵、雙硫鍵等作用力以解構分子的 主體結構。 1.氧化雙硫鍵： 利用甲酸使雙硫鍵氧化成磺酸鍵 2. 防止再氧化： 雙硫鍵 氫硫 氫硫基乙醇 碘乙酸 保護還原生成的 氫硫 3.還原雙硫鍵 還原雙硫鍵 + 環狀化合物 使還原性硫基穩定 (二) 胜肽鏈組成分析 1.胺基酸組成分析(amino acid composition analysis)： 將蛋白質樣品用6M HCI在110℃下封管水解24 小時，然後用胺基酸分析儀(amino acid analyzer)測出胺基酸的種類，以及每種胺基 酸的相對百分比含量。再計算每種胺基酸的殘 基數。 2.胜肽鏈末端分析(peptide chain end-group analysis)： (1)N-端測定(N-End Determination)： A.DNFB法 B.苯異硫氰酸鹽法 C.丹磺醯氯法 D.胺胜肽酶法 (2)C-端測定(C-end-group determination)： A.胼解法 B.羧胜肽酶法 A.DNFB法 （Sanger法，dinitrofluorobenzene method）： 黃色化合物 與已知的標準DNP-胺基酸比較， 可分析出N端所鍵結的為哪一種胺基酸 B.苯異硫氰酸鹽法（Edman法，phenylisothiocyanate method） 所生成的PTH-胺基酸用乙酸乙酯 抽提後，再進行鑑定。 現有測定胺基酸序列的 胺基酸順序儀(amino acid sequencer) 基本上都是根據此原理設計的。 C.丹磺醯氯法（DNS法，dansyl chloride method）： DNS與胜肽鏈N-端作用，生成DNS-胜肽鏈，再 用酸水解可得到DNS-胺基酸，可用螢光檢測 法 進行鑑定，因為DNS-胺基酸有螢光。 此法靈敏度高。 酸水解 D.胺胜肽酶法(aminopeptidase method) 胺胜肽酶是專門水解胺胜鏈N-端胺基酸的酵素， 所以可做N-端胺基酸的鑑定 (2)C-端測定(C-end-group determination)： A.胼解法(hydrazinolysis method) 再用DNFB法進行鑑定 B.羧胜肽酶法(carboxypeptidase method)： 羧胜肽酶(carboxypeptidase)將多胜肽或蛋白質在 pH8.0、30℃時與羧胜肽酶作用，依據一定的時間 間隔取樣分析，測定所釋放出來的胺基酸的種類 和數量，即可知道C-端的胺基酸排列順序。 (三) 裂解成較小片段 為便於順序分析，需將一條長的多胜肽鏈裂解成約含 10~15個殘基的小片段(small fragment)，這些小片段很容易 用Edman 法進行序列分析。 1.化學方法：最常用的是用溴化氰(CNBr)處理。 特異性的斷裂peptide chain中的Met的COOH，所以 處理後會產生帶有C端的Met小片段 2.酶裂解法：常用胰蛋白酶(trypsin)和胰凝乳蛋白酶 (chymotrypsin)。 胰蛋白酶特異性的斷裂鹼性胺基酸的COOH，所以處 理後會產生以Arg或Lys為C端的小片段 胰凝乳蛋白酶特異性的斷裂芳香族胺基酸的COOH， 所以處理後會產生以Phe, Tyr或Trp為C端的小片段 將小片段分離，然後即可用Edman降解或利用胺 基酸順序儀測定每個小片段的胺基酸順序，最後 將所有已知順序的小片段進行重疊比較，確定整 個胜肽鏈的胺基酸順序。 應用這種所謂片段重疊法(fragment overlapping method)， Frederick Sanger等人(1955)首先確定了牛胰島素(insulin) 的結構。胰島素是由兩條胜肽鏈組合而成的， 其結構見（圖5-6）。