Transcript Gene 1
Banche dati e software per l’identificazione di interazioni fra geni Supponiamo di voler studiare le differenze nell’espressione genica fra due trascrittomi. Per esempio: cellule trattate con un composto esogeno a confronto con cellule non trattate Composto esogeno un tessuto tumorale a confronto con uno sano realizziamo un esperimento microarray Cos’è un microarray? Fasi di un esperimento microarray • Estrazione mRNA • Retrotrascrizione e Marcatura • Ibridazione • Scansione • Analisi dei dati Output dell’esperimento: lista di geni differenzialmente espressi Rank GeneSymbol Accession Number (Transcript) Description Differential expression (Up- or Down-regulation) P-value 1 DUSP1 NM_004417 ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1 (DUSP1), mRNA 0.7606655 0.0004 2 SRGAP1 BC029919 gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1, mRNA 1.0329521 0.00038 3 HES1 NM_005524 0.7117039 0.00026 4 SMAD3 U68019 -0.4286814 0.00021 5 RHEBL1 NM_144593 -0.5070915 0.00018 7 FZD10 NM_007197 -0.6491815 0.00015 8 RGS16 NM_002928 0.6270794 0.00012 9 GPR56 NM_201525 -0.3310189 0.0001 10 ZNF831 NM_178457 0.3905212 0.008 11 TFPI NM_001032281 -0.5849317 0.0075 ... ... ... ... ... ... 600 BTG1 NM_001731 ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1, anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05 ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1, (Drosophila) (HES1), mRNA gb|Homo sapiens mad protein homolog (hMAD-3) mRNA, complete cds ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in brain like 1 (RHEBL1), mRNA ref|Homo sapiens frizzled homolog 10 (Drosophila) (FZD10), mRNA ref|Homo sapiens regulator of G-protein signaling 16 (RGS16), mRNA ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56 (GPR56), transcript variant 3, mRNA ref|Homo sapiens zinc finger protein 831 (ZNF831), mRNA ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA Obiettivo: ricostruire la rete di interazioni fra geni per comprendere quale sia l’effetto a livello molecolare del fenomeno biologico indagato Esempi di reti di interazione… Ricostruzione delle interazioni Rank GeneSymbol Accession Number (Transcript) Description Differential expression (Up- or Down-regulation) P-value 1 DUSP1 NM_004417 ref|Homo sapiens dual specificity phosphatase 1 (DUSP1), mRNA 0.7606655 0.0004 2 SRGAP1 BC029919 gb|Homo sapiens SLIT-ROBO Rho GTPase activating protein 1, mRNA 1.0329521 0.00038 3 HES1 NM_005524 0.7117039 0.00026 4 SMAD3 U68019 -0.4286814 0.00021 5 RHEBL1 NM_144593 -0.5070915 0.00018 7 FZD10 NM_007197 -0.6491815 0.00015 8 RGS16 NM_002928 0.6270794 0.00012 9 GPR56 NM_201525 -0.3310189 0.0001 10 ZNF831 NM_178457 0.3905212 0.008 11 TFPI NM_001032281 -0.5849317 0.0075 ... ... ... ... ... ... 600 BTG1 NM_001731 ref|Homo sapiens B-cell translocation gene 1, anti-proliferative (BTG1), mRNA -0.3668739 0.05 ref|Homo sapiens hairy and enhancer of split 1, (Drosophila) (HES1), mRNA gb|Homo sapiens mad protein homolog (hMAD-3) mRNA, complete cds ref|Homo sapiens Ras homolog enriched in brain like 1 (RHEBL1), mRNA ref|Homo sapiens frizzled homolog 10 (Drosophila) (FZD10), mRNA ref|Homo sapiens regulator of G-protein signaling 16 (RGS16), mRNA ref|Homo sapiens G protein-coupled receptor 56 (GPR56), transcript variant 3, mRNA ref|Homo sapiens zinc finger protein 831 (ZNF831), mRNA ref|Homo sapiens tissue factor pathway inhibitor (lipoprotein-associated coagulation inhibitor) (TFPI), transcript variant 2, mRNA …ma le interazioni? Vorremmo vedere simultaneamente se e come interagiscono i geni di interesse Per sapere qualcosa in più sulle interazioni fra geni: Banche dati di pathway e ontologie • Kegg http://www.genome.jp/kegg/ - Kegg GenesInfo sui geni e sui trascritti - Kegg PathwayInfo sulle reti di trasduzione del segnale genico (pathway) • Gene Ontology http://www.geneontology.org/ Informazioni sulla classificazione ontologica dei geni\prodotti genici KEGG: Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes Contenuti: Rappresentazione dei dati in KEGG • Entity: una molecola o un gene - identificata, eccetto che per GENE and ENZYME, con 3 lettere + 5 numeri: • Binary relation: una relazione fra due entity • Network: un grafo formato da un set di entity collegate • Pathway: una rete di co-regolazione; un network o un insieme di network Legenda dei simboli Un esempio di Pathway KEGG PATHWAY E’ una collezione di diagrammi o mappe ciascuna corrispondente a una rete di co-regolazione biologica con significato funzionale. Ogni pathway è identificato da: -3 lettere -> specifiche per ciascun organismo -5 numeri -> identificativi della mappa Essi possono essere: - Creati e curati manualmente - Generati attraverso simulazioni computazionali Ci sono: - Pathway di riferimento: generati dall’unione di evidenze sperimentali tratte da organismi differenti - Pathway specifici: che raccolgono le informazioni provenienti da un determinato organismo -Pathway globali: che collegano più pathway insieme Sezioni di KEGG Pathway Pathway metabolici 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. Global Map Metabolism Carbohydrate Energy Lipid Nucleotide Amino acid Other amino acid Glycan Cofactor/vitamin Terpenoid/PK Other secondary metabolite Xenobiotics Reaction module Chemical structure Genetic Information Processing Environmental Information Processing Cellular Processes Organismal Systems Human Diseases Pathway regolatori Drug Development KEGG ORGANISMS • Nei pathway metabolici le entity sono quasi esclusivamente enzimi • Nei pathway regolatori le entity rappresentano quasi sempre prodotti genici, ma troviamo anche composti chimici, DNA e altre molecole Pathway di riferimento Standard view -generato dall’unione di evidenze sperimentali provenienti da organismi multipli - individuato dal prefisso map Pathway di riferimento KEGG ORTHOLOGY (KO) view I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola Pathway di riferimento Enzyme (EC) view I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola Pathway di riferimento Reaction (RN) view I geni assegnati ad un KO group sono evidenziati in viola Pathway organismo-specifico generato da informazioni provenienti da un unico organismo o informazioni da KEGG ORTHOLOGY I geni specifici dell’organismo coinvolto nel pathway sono colorati in verde Pathway specifico per più organismi Pathway organismo-specifico + drug info I geni coinvolti in malattie sono evidenziati in rosa I geni target di farmaci sono evidenziati in celeste KEGG DRUG Contiene informazioni su: • Farmaci approvati in Giappone, USA ed Europa che riguardano la loro struttura chimica • Target dei farmaci ed enzimi che li metabolizzano • Storia della trasformazione della struttura chimica delle molecole rappresentate attraverso mappe I farmaci sono identificati con la lettera D + 5 numeri ES: Gleevec D01441 KEGG DRUG Pathway globali – reference pathway Pathway globale – Homo sapiens Pathway globale – Arabidopsis thaliana Pathway globale Homo Sapiens + Arabidopsis Thaliana Disease Pathway Map Stadi della malattia sono visti come perturbazioni di processi di regime Vogliamo sapere se ci sono gruppi di geni differenzialmente espressi mappati nei pathway e in quali pathway Pathway-Express Pathway-Express : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm Impact Analysis: mappatura dei geni differenzialmente espressi nei pathway molecolari e valutazione della propagazione della perturbazione della trasduzione del segnale genico provocata dalla variazione di espressione genica Pathway-Express : http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm L’Impact Factor è formato da tre contributi: - Numero di geni differenzialmente espressi mappati in un pathway rispetto al numero di geni che formano il pathwaylivello di rappresentatività della lista dei geni DE nel pathway - Fold-change dei geni differenzialmente espressi mappatientità della perturbazione del pathway provocata dai geni differenzialmente espressi - Posizione dei geni differenzialmente espressi all’interno del pathwayun gene posizionato a monte (p.es. sulla membrana cellulare o su un nodo cui fa capo una sottorete) di una cascata di segnale è “più importante” di un gene posizionato a valle 35 GeneOntology Cos’è un’ontologia? An ontology is a specification of a conceptualization that is designed for reuse across multiple applications and implementations. …a specification of a conceptualization is a written, formal description of a set of concepts and relationships in a domain of interest. Peter Karp (2000) Bioinformatics 16:269 … un insieme di definizioni Cos’è un’ontologia genica? Ontologia genica: un vocabolario di definizioni, indipendente dall’organismo, da utilizzare per descrivere i geni attraverso i loro prodotti genici (proteine) • “trasferimento” delle informazioni funzionali fra organismi differenti a parità di complessità del genoma • “trasferimento” delle informazioni funzionali da organismi “meno complessi” ad organismi “più complessi” • univocità nella descrizione delle caratteristiche di un gene Gene Ontology http://www.geneontology.org/ Consorzio che si occupa della definizione delle ontologie geniche per la classificazione dei geni attraverso i loro prodotti genici http://www.geneontology.org/ Che tipo di informazione è rilevante per descrivere un prodotto genico? • Che cosa codifica il gene? Funzione molecolare • Dove e quando il prodotto agisce? Componente cellulare • In che cosa è coinvolto? Processo biologico Tre ontologie • Funzione molecolare -> definizioni che riguardano la funzione biochimica di un prodotto genico - enzima, lega gli ioni calcio, lega i nucleotidi, etc • Processo biologico -> definizioni che riguardano il processo di coregolazione all’interno del quale il prodotto genico può essere inserito - metabolismo di una molecola, glicolisi, ciclo della cellula, apoptosi • Componente cellulare -> definizioni che riguardano il “luogo” della cellula nel quale un determinato prodotto genico può agire - membrana cellulare, reticolo endoplasmatico Componente cellulare • Dove agisce un prodotto Componente cellulare Componente cellulare Funzione molecolare • Attività o compito del prodotto genico glucose-6-phosphate isomerase activity Funzione molecolare 24th Feb 2006 Jane Lomax insulin binding insulin receptor activity Processo biologico -una serie di eventi a cui prende parte il prodotto cell division Processo biologico transcription Processo biologico regulation of gluconeogenesis Processo biologico limb development GO evidence codes I geni sono associati a categorie sulla base di evidenze di diverso tipo Statistiche di GeneOntology Com’è organizzata un’ontologia? Ontologie Ogni ontologia è strutturata in un Grafo Aciclico Diretto (DAG) Ogni livello del grafo costituisce una categoria ontologica o GO term A ciascun GO term è associata una definizione univoca Categorie ontologiche Struttura di un’ontologia • I GO term sono legati per mezzo di due tipi di relazioni: – is-a – part-of Struttura di un’ontologia cell is-a part-of membrane chloroplast mitochondrial membrane chloroplast membrane Struttura di un’ontologia • Ogni ontologia non è una lista di termini biologici, ma è strutturata in livelli gerarchici Struttura di un’ontologia Lo stesso gene può essere annotato in più di un GO term gene A Struttura di un’ontologia I geni possono essere raggruppati sulla base di livelli gerarchici e percorsi definiti dall’utente sono ammesse le parentele multiple cell Directed Acyclic Graph (DAG) - multiple parentage allowed membrane chloroplast mitochondrial membrane chloroplast membrane Come funziona GeneOntology? • GO è organismo indipendente - Alcuni termini, soprattutto quelli ai più bassi livelli di gerarchia e di dettaglio, possono essere specifici per certi organismi - photosynthesis – Quando però essi vengono collassati insieme ai livelli con più alto ordine gerarchico la dipendenza dall’organismo scompare Anatomia di un GO term id: GO:0006094 name: gluconeogenesis namespace: process def: The formation of glucose from noncarbohydrate precursors, such as pyruvate, amino acids and glycerol. [http://cancerweb.ncl.ac.uk/omd/index.html] exact_synonym: glucose biosynthesis xref_analog: MetaCyc:GLUCONEO-PWY is_a: GO:0006006 is_a: GO:0006092 unique GO ID term name ontology definition synonym database ref parentage GO tools • GO mette a disposizione strumenti per fare ricerca ottimizzata nella banca dati • Altri gruppi hanno creato strumenti con differenti propositi: http://neurolex.org/wiki/Category:Resource:Gene_Ontology_Tools Analisi tradizionale Gene 1 Apoptosis Cell-cell signaling Protein phosphorylation Mitosis … Gene 3 Growth control Gene 4 Mitosis Nervous system Oncogenesis Pregnancy Protein phosphorylation Oncogenesis … Mitosis … Gene 2 Growth control Mitosis Oncogenesis Protein phosphorylation … Gene 100 Positive ctrl. of cell prolif Mitosis Oncogenesis Glucose transport … Analisi tradizionale • Ricerca gene by gene • Richiede di fare una ricerca in letteratura • time-consuming Se utilizziamo le annotazioni fornite da GO… …il lavoro è già fatto! GO:0006915 : apoptosis Raggruppamento per processo Mitosis Gene 2 Gene 5 Gene45 Gene 7 Gene 35 … Apoptosis Gene 1 Gene 53 Positive ctrl. of cell prolif. Gene 7 Gene 3 Gene 12 … Glucose transport Gene 7 Gene 3 Gene 6 … Growth Gene 5 Gene 2 Gene 6 … Come facciamo ad ottenerlo automaticamente e…. ….Esiste un modo per associare una significatività statistica a questi raggruppamenti di geni? Over-representation analysis: - Esistono gruppi di geni differenzialmente espressi rappresentati in maniera “sproporzionata” in qualche GO term? - Questa rappresentatività “sproporzionata” è statisticamente significativa rispetto al totale dei geni che vengono annotati in quel GO term? 68 Quanto è probabile che gruppi di geni differenzialmente espressi vengano catalogati in un GO term “by chance”? 80 70 60 50 40 30 20 10 0 mitosis microarray 1000 genes experiment 100 genes differentially regualted apoptosis positive control of glucose transport cell proliferation mitosis – 80/100 apoptosis – 40/100 p. ctrl. cell prol. – 30/100 glucose transp. – 20/100 Se osserviamo il numero di geni distribuiti sull’array e appartenenti alle stesse categorie, possiamo calcolare la probabilità che ci interessa: Process mitosis apoptosis p. ctrl. cell prol. glucose transp. Genes on array 800/1000 400/1000 100/1000 50/1000 # genes expected in 100 random genes 80 40 10 5 Onto-Express occurred 80 40 30 20 Onto-Express: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm GO term significativi nell’ontologia Molecular Function Onto-Express: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm Espansione delle ontologie e visualizzazione annidata dei GO term OntoExpress: http://vortex.cs.wayne.edu/projects.htm Cellular Component Molecular Function Biological Process 73 Interpretazione biologica di una lista di geni: data/text mining Sfruttare -le reti di interazioni (gene network) fra bio-entità costruite utilizzando dati di letteratura o info da banche dati eterogenee per comprendere quale sia l’effetto a livello molecolare del fenomeno biologico indagato - Co-occorrenza di bio-entità (geni, proteine, parole chiave, etc) in testi - Individuazione di connessioni fra bio-entità riportate in database di interazioni biologiche (pathway, interazioni fra proteine, interazioni chimiche o fisiche, co-espressione in esperimenti di espressione genica, etc.) Text mining: Individuazione della co-occorrenza di parole in un testo Ricorrenza in un testo di coppie di elementi bio-entità: • coppie di nomi di geni • coppia gene/parola chiave “X binds Y”, “X phosphorylates Y”, “X is involved in Y process”, “X is a marker for Y disease”, … Text mining: Individuazione della co-occorrenza in un testo Ricorrenza in un testo di coppie di elementi linguistici (bioentità): • coppie di nomi di geni • coppia gene/parola chiave … ma come si fa? 1S) Individuazione nel testo di informazioni (contenute in titolo, testo e abstract) e metainformazioni (affiliazione, giornale, etc)data retrieving and selection 2S) Analisi grammaticale del testo per individuare i diversi tipi di parole: sostantivi, aggettivi, verbi e nomi propri parsing 3S) Conteggio del il numero di volte in cui ogni parola appare nei testiinformation extraction e indexing 4S) Assegnazione di un punteggio ad ogni testo sulla base della co-occorrenza delle parole cercate (X e Y ) quanto più è alta in un testo tanto più quel testo è attinente alla co-occorrenza considerata e attesta la relazione fra X e Yscoring 5S) Rappresentazione grafica della connessione tramite una rete Text mining: Individuazione della co-occorrenza in un testo Alcuni algoritmi sono capaci di: -rilevare sulla base di un vocabolario il tipo di interconnessione fra le bio-entità considerate “X binds Y”, “X phosphorylates Y”, “X is involved in Y process”, “X is a marker for Y disease”, … - dare un peso alla co-occorrenza a seconda della distanza che separa le bio-entità espressa in numero di parole - rilevare connessioni indirette: X è connesso a Y, Y è connesso a Z X è connesso a Z ciò può influire sulla valutazione dell’attinenza del documento alla connessione fra le bio-entità Cosa si può fare con il Data mining? Costruire reti di “interazioni eterogenee” Banche dati utili: - MIPS: Munich Information center for Protein Interaction - BIND: Biomolecular Interaction Network Databases - HPRD: Human Protein Reference Database - IntAct: InterAction - Reactome - STRING:Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins -… Letteratura Scientifica Integrazione di informazioni eterogenee Esistono gruppi di geni della mia lista che sono coinvolti in malattie? Disease Ontology, GeneRIF e FunDO Disease Ontology - Definizioni univoche e standardizzate di malattie - Integra MeSH di NCBI Esempi da DO Disease Ontology GeneRIF Database MetaMapTransfer FunDO Software basato sul text-mining che associa geni da GeneRIF e malattie da Disease Ontology FunDO – Functional Disease Ontology FunDO – Functional Disease Ontology 314 geni differenzialmente espressi In quali malattie sono coinvolti? GNCPro – Gene Network Central PRO GNCPro – Gene Network Central PRO Sottomissione di 4 geni GNCPro aggiunge 5 geni “vicini” a quelli sottomessi per fornire nuove vie di connessione fra i geni COREMINE • Motore di ricerca biomedico • Fornisce set di informazioni ordinate per attinenza con l’oggetto della query • Consente di salvare le ricerche effettuate e di creare gruppi di discussione su temi di ricerca COREMINE • Input data da 13 differenti categorie • Database messi in relazione per creare l’output COREMINE • Altre sorgenti consultabili per arricchire l’output COREMINE …take-home message • Ogni banca dati fornisce un “pezzo” di informazione • Ogni strumento di navigazione fornisce una peculiare “view” delle informazioni • Non esiste UNA banca dati omnicomprensiva • Non esiste UNO strumento capace di collezionare tutte le informazioni frazionate nelle banche dati • L’uso di più strumenti consente di collezionare i diversi “pezzi” di informazione • La costruzione del “puzzle” è compito di chi interpreta i dati Esercitazione http://131.114.94.135/lezioni/ADO_tecnici • Cercare i seguenti GO term: 0030182 0051402 • Per ciascuno di essi: - fare l’anatomia dell’ontologia evidenziando i GO term sulla base degli “is-a” o “part-of” - indicare quanti sono i prodotti genici associati a ciascun GO term a seconda dei termini di cui sono “is-a” o “part-of” - scaricare e salvare la tree view e la graph view ed indicare chi sono i GO term “padri” dei GO term considerati - indicare quali GO term dell’albero visualizzato sono “is-a” o “part-of”