Transcript mikroszkópos_gyak

Mikrobiológia labor
Segédanyag a közös mikroszkópos gyakorlatokhoz
Összeállították:
Dr. Janzsó Béla
Dr. Molnár Mónika
Nagy Zsuzsanna
Dr. Suhajda Ágnes
Tolner Mária
2013. március
Mikroszkóp képalkotása 1.
B: preparátum
c’ : az objektív által alkotott,
fordított állású nagyított valódi
kép
c : az okulár által c’-ről alkotott
nagyított virtuális kép
Mikroszkóp nagyítása:
objektív x okulár
Mikroszkóp képalkotása 2.
A mikroszkóp felbontóképessége
d = az a legkisebb távolság a tárgyon, amelynek végpontjait a mikroszkópos
képen még különállónak látjuk
Abbe → d = λ / sinµ ill. λ / n ·sinµ
ahol
λ: a megvilágító fény hullámhossza,
µ: a beeső fény-nyaláb félkúpszöge
n: a preparátum és az objektív közötti közeg
törésmutatója
n · sinµ = A (NA) az objektív numerikus aperturája
levegő → n = 1
immerziós olajok → n = 1,3 -1,6
Olajimmerzió használata csak
speciális objektívvel!
A mikroszkóp felbontóképessége (folyt.)
Az optikai tengellyel
párhuzamos megvilágítás
esetén:
d= λ / n ·sinµ = λ / A
↑
Ferde megvilágítás esetén:
d= λ / 2 ·n ·sinµ = λ / 2A
Élesztőgombák
Saccharomyces cerevisiae
(sütő- vagy pékélesztő)
Sejtjei oválisak, 5–10 m átmérőjűek,
sarjadzással, más néven bimbózással
szaporodik.
Élesztőgombák
Schizosaccharomyces pombe
Sejtjei lekerekedett végű henger
alakúak. Hasadással szaporodik.
Átmérője kb. 3,5 m, hossza pedig
kb. 8-14 m.
A sarjadzó élesztővel (S. cerevisiae)
ellentétben a Schizosacch. pombe
osztódása szimmetrikus: két (közel!)
azonos méretű leánysejt keletkezik.
Penészgombák
Mucor sp. (fejespenész)
Mucor racemosus spóratartó fejek (sporangia)
spórákkal
Mucor mucedo tenyészet
Penészgombák
Rhizopus sp.
Rhizopus stolonifer spóratartó fej
Rhizopus nigricans
tenyészet kenyéren
„lépegető penész”
Penészgombák
Aspergillus sp.
Aspergillus niger (feketepenész vagy korompenész)
 konídiumtartóról lesodródott konídiumok
konídiumtartó térhatású felvételen

Penészgombák
Penicillium sp.
Penicillium expansum
 ecsetszerű konídiumtartók és
lesodródott konídiumok
konídiumtartó térhatású felvételen

Penicillium sp. tenyészet Petri-csészében
Baktériumok
Lactobacillus plantarum
Scanning elektronmikroszkópos felvétel
Mikroszkópos felvétel
festett preparátumról
Baktériumok
Lactococcus (Streptoccocus) lactis
Scanning elektronmikroszkópos felvétel
Mikroszkópos felvétel
Gram színezett tenyészetről
(Gram+ baktérium)
Baktériumok
Escherichia coli
Fakultatív anaerob, pálcika alakú baktérium. Általában peritrich csillós, de lehet csillótlan
is. Könnyen és jól tenyészthető. Rendszerint melegvérű állatok tápcsatornájának alsó
szakaszában él. A legtöbb szerotípus ártalmatlan, de vannak emberben
ételmérgezést okozó változatai is. Fekális eredetű szennyezés indikátora.
A veszélytelen törzsek az emésztőrendszer normális flórájához tartoznak, K2-vitamint
termelnek. Jelenlétük megnehezíti egyes patogének elszaporodását a
bélrendszerben.
Gram festés szerint negatív
Baktériumok
Pseudomonas fluorescens
Nagyon változatos metabolizmussal rendelkező, talajban, természetes vizekben gyakran
előforduló, ún. ubikviter baktérium. Obligát aerob, pálcika alakú, többszörös
flagellummal rendelkezik.
Tenyészete UV fényben zöldeskék színben fluoreszkál. Gram szerint (az E. coli -hoz
hasonlóan) negatív festődésű.
Baktériumok
Bacillus subtilis
Szénabacilus néven is ismert, a talajban, növényeken általánosan fellelhető Gram+,
baktérium. Pálcika formájú, aerob, endospórás. Sok ostora van, ezért gyors
mozgásra képes.
Bacillus endospórák spóraszínezéssel
Scanning elektronmikroszkópos felvétel
Baktériumok
Streptomyces sp.
(fonalas baktériumok)
Streptomyces coelicolor
tenyészete Petri-csészében 
Streptomyces rimosus
Speciális színezési módszerek
• Mikroorganizmusok minőségi vizsgálata
• Többféle színezék alkalmazása
• Mikroorganizmusok differenciálása
• Speciális sejtalkotórészek kimutatása
Baktériumok sejtfaltípusai
Csoport
Szervezet
Sejthatároló
felület összetétele
1.
Mycoplasma sp.,
Halobacterium,
protoplaszt (Bacillus
megaterium)
Citoplazmamembrán
2.
Gram-pozitív
baktériumok
Sejtfal (egyrétegű),
citoplazmamembrán
Gram-negatív
baktériumok
Sejtfal (többrétegű),
citoplazmamembrán
Lampropedia hyalina
Külső kettős köpeny,
cementálóréteg,
sejtfal, citoplazmamembrán
3.
4.
Speciális
jellemzők
peptidoglikán
hiányzik
peptidoglikán van
peptidoglikán van
?
Gram- és Gram+ sejtfal felépítése
Gram-színezés
• Hans Christian Joachim Gram (dán kutató)
• Elv: trifenil-metán típusú színezék + jód oldat
jódpararozanilin komplex Gram+ sejtekből nem mosható
ki, Gram- sejtekből igen
+ kontraszt színezés
• Eredmény
http://faculty.ccbcmd.edu/courses/bio141/l
abmanua/lab6/images/Ecoli01_scale.jpg
http://homepages.wmich.edu/~rossbach/bi
os312/LabProcedures/Gramposcocci.jpg
• Japán Gram-próba (40 % KOH)
http://www.path.cam.ac.uk/Microbiolo
gy/BI_Bacteriology/CL_Clostridia/M_
BI_CL_20small.jpg
Gram-festés menete
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
Kenet készítés
Bacillus cereus Gram (+)
Szárítás
Escherichia coli Gram (–)
Rögzítés
Festés kristályibolyával 2 percig /leönteni!/
Lugol 2 perc
Mosás aceton-etanollal
Mosás csapvízzel
Festés szafraninnal 2-3 perc
Mosás csapvízzel
Mikroszkópizálás (40x)
Szárítás
Olajimmerzió
 Gram (+) sejt kék
 Gram (–) sejt piros
Tok kimutatása
• Tok: nyálkaburok, körülveszi a sejtet
• Anyaga: homogén vagy heterogén,
– poliszacharid, polipeptid, aminocukor, fehérjelipopoliszacharid
• Egyszerű vagy bordás
• Szerepe:
– patogének virulenciája, véd a fagocitózis ellen
– véd a kiszáradástól
– tartalék tápanyag
– lokalizáció
– tápanyag-adszorpció
• Kimutatás:
– negatív festés
Mitokondrium és glikogén kimutatása
• Mitokondrium : kémiai energia átalakítása
és termelése
Kimutatása:
o Redox festékkel
• Glikogén: tartaléktápanyag
Kimutatása:
o Lugollal
Speciális sejtalkotórészek megfestése
• Tokfestés
Schizosaccharomyces pombe
Egy csepp tusban szuszpendálunk egy kacsnyi 72 órás mikrobát.
• Mitokondrium festés
Saccharomyces cerevisiae (T22)
Egy csepp Janus zöld oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás
T22-t.
• Glikogén festés
Saccharomyces cerevisiae (T22)
Egy csepp Lugol oldatban szuszpendálunk 1 kacsnyi 24 órás T22-t.
Endospóra képzés
•
•
•
•
•
•
Bacillus, Clostridium, Sporosarcina sp.
A szülősejt kitartó állapota, nincs anyagcseréje
A túlélést teszi lehetővé
Rendkívül ellenálló
Elhelyezkedés: terminális, centrális, szubterminális,
Alak: szubtilisz (1,2), klosztrídium (3,4,5,6)
http://w3.georgikon.hu/tanszekek/Novtud/Mikrobio
logia/agr%20mikro%201.pdf
Spóraszínezés
Malachitzölddel
1. Szuszpenzió készítése
2. Szárítás
3. Rögzítés /láng felett áthúzni 2-3
szor/
4. 10 percig szárítópadkán
malachitzölddel melegítjük /ne
száradjon be/
5. Mosás 1/2 percig vízzel
6. Szafraninos festés 3 perc
7. Mosás csapvízzel
8. Mikroszkópizálás (40x)
Spóra: zöld
Vegetatív sejt: piros
Karbolfuxinnal
1.
2.
3.
4.
Szuszpenzió készítése
Szárítás
Rögzítés /láng felett 2-3szor áthúzni/
10 percig szárítópadkán Ziehl-Nielsen
féle karbolfuxinnal melegítjük /ne
száradjon be/
5. Vizes öblítés
6. 10%-os kénsavval mosás
7. Vizes öblítés
8. Festés metilénkékkel 2-3 perc
9. Mosás csapvízzel
10. Mikroszkópizálás (40x)
Spóra: piros
Vegetatív sejt: kék
Mérés mikroszkóppal
Okulár mikrométer
Objektív mikrométer
(a mikroszkóp szemlencséjébe
kell beilleszteni)
Objektív mikrométerrel kalibrálandó
100 osztást tartalmaz
mérőskálát tartalmazó, csiszolt
tárgylemez,
amelyen 1 osztás 10 m
1 mm = 100 rész (0,01 mm = 1 rész)
Okulár mikrométer
kalibrálása
Az okulár mikrométeren egy 5 vagy 10 mm hosszú vonalszakasz 100 részre van osztva. Ezt a
mérőokulárba helyezzük.
Az objektív mikrométer egy csiszolt tárgylemez, amelyen egy 1 mm-es vonalszakasz 100 részre van
osztva és fedőlemezzel le van fedve.
Mikroszkópos méréshez meg kell állapítani az okulár mikrométer 1 osztásközének az értékét. Ehhez
az objektív mikrométert a tárgyasztalra helyezzük, az objektív mikrométer osztásait élesre állítjuk.
A látótérben most a két mikrométer-osztást egyszerre látjuk. A tárgyasztal mozgatásával és az
okulár elfordításával a két mikrométer-osztást fedésbe hozzuk úgy, hogy a két kezdőpont
egybeessen. Megkeressük a két skálán azt a pontot, ahol a két osztásvonal egybeesik.
Megszámoljuk az objektív- és az okulár mikrométer osztásvonalainak számát eddig a pontig.
Az okulár mikrométer 1 osztásközének értéke μm-ben: (objektív mikrométer-osztások száma × 10)
/ (okulár mikrométer-osztások száma). Különböző nagyításoknál különböző értékeket kapunk.
Dr. Horváth Sándor: Mikrobiológiai praktikum, Tankönyvkiadó, Budapest, 1980
Az okulár mikrométer kalibrálása után mérhetünk a
mikroszkóppal
sejtek méretét (átmérő, hossz, vastagság), szálas anyagok vastagságát,
mikroszkópikus részecskék méreteit stb.
Mikroszkópos számlálókamra: Bürker
Élesztők és penészgomba konídiumok, spórák számlálására
A számlálókamrák különlegesen kiképzett tárgylemezek, amelyeken ismert területű beosztás található.
A fedőlemez feltételével meghatározott magasságú réteg keletkezik és ezáltal a beosztásban
elhelyezkedő folyadék térfogata ismert.
A Bürker kamra két négyzethálós beosztású
teret tartalmaz.
Kamra mélysége: 0,1 mm
X: 1/400 mm2
Y: 1/25 mm2
Számlálás Bürker kamrában
A Bürker-kamra két egymástól vájattal
elválasztott négyzetes beosztást
tartalmaz, így akár két különböző
szuszpenzió vizsgálatára alkalmas. A
megszámlálandó négyzeteket a
számlálókamra egész felületéről
véletlenszerűen választjuk ki. A
számlálásnál célszerű következetesen
a felső és a jobb oldali határvonalon
levő sejteket a négyzet belsejében
levőkhöz adni.
Az 1 ml-ben lévő sejtszámot úgy
számítjuk ki, hogy a kis négyzetekhez
tartozó átlagos sejtszámot 4×106-nal,
a nagy négyzetekhez tartozót 2,5×105nel szorozzuk.