Transcript fluorek jako czynnik prozapalny i ograniczający

FLUOREK JAKO CZYNNIK PROZAPALNY I
OGRANICZAJĄCY BIODOSTĘPNOŚĆ ATP W
KOMÓRKACH MAKROFAGÓW
Krzysztof Woźniak
Studenckie Koło Naukowe przy Samodzielnej Pracowni
Biochemii i Chemii Medycznej, Wydział Nauk o Zdrowiu
• SĄ JEDNYM Z NIEBEZPIECZNIEJSZYCH ZAGROŻEŃ
PRZEMYSŁOWYCH
• ZWIĄZKI FLUORU WYSTĘPUJĄ W WODZIE,
POWIETRZU I ŻYWNOŚCI
•ZATRZYMYWANE W TKANKACH TWARDYCH MOGĄ
BYĆ Z NICH STOPNIOWO UWALNIANE
• DŁUGOTRWAŁA EKSPOZYCJA NA FLUOREK
STYMULUJE STRES OKSYDACYJNY
• STRES OKSYDACYJNY JEST STYMULATOREM
PROCESU MIAŻDŻYCOWEGO
• W POWSTAWANIU BLASZKI MIAŻDŻYCOWEJ
UCZESTNICZĄ MAKROFAGI
Uproszczony schemat powstawania miażdżycy
Monocyt
ROS
LDL
Ox-LDL
Komórka
piankowata
Receptor
LDL
Receptor
Zmiatający CD36
Makrofag
ROS - Reactive Oxygen Species
(Reaktywne formy tlenu)
• GŁÓWNYM MIEJSCEM POWSTAWANIA
REAKTYWNYCH FORM TLENU (ROS) W
MAKROFAGACH SĄ MITOCHONDRIALNE ENZYMY
ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO
• ŹRÓDŁEM ROS W MAKROFAGACH SĄ TAKŻE
ENZYMY AKTYWOWANE PODCZAS RÓŻNICOWANIA
MONOCYTÓW W MAKROFAGI (LIPOKSYGENZY,
CYKLOOKSYGENAZY, OKSYDOREDUKTAZA NADP)
Mając na uwadze, że zwiększona synteza ROS w
makrofagach jest czynnikiem ryzyka rozwoju procesu
miażdżycowego za cel pracy przyjęto próbę oceny
wpływu fluorków na:
• WEWNĄTRZKOMÓRKOWĄ SYNTEZĘ ROS
• AKTYWNOŚĆ ENZYMÓW ŁAŃCUCHA
ODDECHOWEGO
• SYNTEZĘ ATP
• BADANIA BYŁY PRZEPROWADZONE NA
MAKROFAGACH UZYSKANYCH Z LINII KOMÓREK
MONOCYTARNYCH THP-1
• MAKROFAGI HODOWANO Z ROZTWORAMI
FLUORKÓW O STĘŻENIU 1,3 i 10 μΜ
• STRES OKSYDACYJNY OZNACZANO POPRZEZ
POMIAR WEWNĄTRZKOMÓRKOWEGO UTLENIANIA
DCFH-DA PRZY UŻYCIU CYTOMETRU
PRZEPŁYWOWEGO
• SYNTEZĘ ATP OZNACZANO PRZY UŻYCIU KITU I
CZYTNIKA PŁYTEK ELIZA
1. Inkubacja makrofagów z roztworami fluorków
spowodowała istotne obniżenie ilości ATP w
komórkach wraz ze wzrostem stężenia dodanego
roztworu fluorku,
Ilość syntetyzowanego ATP
900
800
44%
% fluorescencji
700
600
500
92%
400
96%
300
200
100
0
K neg
H2O
F 1μM
F 3μM
- Różnice w odniesieniu do kontroli pozytywnej.
F 10μM
2. W tym samym czasie rosła produkcja wolnych
rodników tlenowych (ROS) wraz ze wzrostem stężenia
dodanego roztworu fluorku
Ilość syntetyzowanych ROS
350
% fluorescencji
300
P< 0,05
250
200
P< 0,05
150
100
50
0
K neg
H2O
F 1μM
F 3μM
F 10μM
3. Dodanie do hodowli inhibitorów łańcucha
oddechowego spowodowało istotne, ale nie całkowite
obniżenie ilości syntetyzowanych ROS
Ilość syntetyzowanego ROS przy dodaniu
inhibitorów łańcucha oddechowego
350
% fluorescencji
300
250
200
150
93%
94%
92%
94%
94%
100
50
0
K neg
H2O
F 1μM
F 3μM
- Różnice w odniesieniu do syntezy ROS bez inhibitorów
F 10μM
4. Dodanie do hodowli apocyniny (inhibitora
oksydoreduktazy NADH) spowodowało nieznaczne
obniżenie syntezy ROS w makrofagach.
Ilość syntetyzowanego ROS
3%
przy dodaniu apocyniny
5%
350
25%
25%
29%
% fluorescencji
300
250
200
150
100
50
0
K neg
H2O
F 1μM
F 3μM
- Różnice w odniesieniu do syntezy ROS bez inhibitorów
F 10μM
• FLUOREK SODU DODANY DO MAKROFAGÓW
PRAWDOPODOBNIE STYMULUJE STRES
OKSYDACYJNY
• OBJAWIA SIĘ TO WZROSTEM SYNTEZY ROS ORAZ
OBNIŻENIEM ILOŚCI SYNTETYZOWANEGO ATP
• PRAWDOPODOBNIE DZIAŁANIE FLUORKU POLEGA
NA ROZPRZĘGANIU ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO
• ZASTOSOWANIE APOCYNINY POTWIERDZIŁO
UDZIAŁ KOMPLEKSU I ŁAŃCUCHA ODDECHOWEGO
W SYNTEZIE ROS
• WZRASTAJĄCE STĘŻENIE FLUORKU BYŁO
ISTOTNIE SKORELOWANE ZE WZROSTEM SYNTEZY
ROS ORAZ ZE SPADKIEM STĘŻENIA ATP