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Tema: 13
CINÉTICA ENZIMÁTICA :
REACCIONES REVERSIBLES
1. Reversibilidad en el mecanismo de Michaelis-Menten:
Ecuación de velocidad reversible
2. Relación de Haldane
3. Validez de la asunción del estado estacionario
1. Reversibilidad en el mecanismo de
Michaelis-Menten
Hasta ahora, en todos los modelos cinéticos estudiados, hemos
considerado que la última reacción era irreversible, …..
k1
k2
E + S === ES --------- E + P
k-1
…… sin embargo, esta última reacción también puede ser
reversible, y de hecho en la mayoría de las reacciones
bioquímicas lo es.
Ecuación de velocidad para reacciones reversible
Es evidente que el mecanismo de Michaelis-Menten, tal y como lo
hemos venido usando, es incompleto, y que debemos considerar
también la reversibilidad de la última reacción. Con lo que el
nuevo modelo tendrá la siguiente forma.
k1
k2
E + S === ES === E + P
k-1
k-2
k1
k2
E + S === ES === E + P
k-1
k-2
d(ES)/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES]
y considerando condiciones de estado estacionario,
tendremos:
d(ES)/dt = 0
Luego,
k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0
d[ES]/dt = k1[E][S] + k-2[E][P] – k2[ES] – k-1[ES] = 0
Intenten despejar [ES]
Recuerden: [E] = [Eo] – [ES]
k1([Eo] – [ES])[S] + k-2([Eo] – [ES])[P] – (k2 + k-1)[ES] = 0
k1[Eo][S] – k1[ES][S] + k-2[Eo][P] – k-2[ES][P] = (k2 + k-1)[ES]
k1[Eo][S] + k-2[Eo][P] = (k1[S] + k-2[P])[ES] + (k2 + k-1)[ES]
(k1[S] + k-2[P])[Eo] = (k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)[ES]
Despejando [ES],

k1 S   k2 PEo
ES 
k1S   k2 P  k2  k1 
Como se trata de una reacción reversible, la velocidad neta a
la que se forma el producto, P, será igual a la velocidad en el
sentido directo () menos la velocidad en el sentido inverso ():
k1
E+S
k2
ES
k-1
E+P
k-2
v = k2[ES] – k-2[E][P]
v  k2 ES  k2 (Eo  ES)P
Sustituyendo el valor de [ES]:


k1 S   k2 PEo
k1 S   k2 PEo
v  k2
 k2 (Eo 
)P
k1S   k2 P  k2  k1 
k1S   k2 P  k2  k1 
Sumando estas fracciones, y poniendo denominador común,
obtenemos un numerador que una vez simplificado conduce a la

siguiente vexpresión:
k1k2 EoS   k1k2 EoP
v
k1S   k2 P  k2  k1 
En el caso particular en el que [P] = 0,
k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]
v = -----------------------------------------(k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)
k1k2 EoS  ¿Les recuerda esta ec. alguna otra?
v
k1S   k2  k1  (dividir numerador y denominador por k1).
k 2 EoS 
v

k 2  k 1 
 S  

k1 


S
v  V max
Km  S 
Ecuación exactamente igual a la obtenida con la
aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.
Si bien, con pleno rigor, [S] debería sustituirse por [So] ya que
para [P] = 0, la [S] = [So]
NOTA: Es importante tener en cuenta que esta simplificación
es posible porque [P] = 0, y no porque hayamos hecho
asunción alguna sobre k-2, ya que k-2[P] = 0 si [P] = 0,
independientemente del valor de k-2.
¿Qué forma tomara la ecuación de velocidad (reversible) cuando
[S] = 0? .
k1k2 EoS   k1k2 EoP
v
k1S   k2 P  k2  k1 
En el caso particular en el que [S] = 0,
k1k2[Eo][S] – k-1k-2[Eo][P]
v = -----------------------------------------(k1[S] + k-2[P] + k2 + k-1)
k2 k1 EoP
v
k2 P  k2  k1
v  V max
dividir numerador y denominador por k-2
k 1 EoP 
v
k 2  k 1
P  
k2
P
Kmp
Km p  P 
Ecuación exactamente igual a la obtenida con la
aproximación del estado estacionario de Brigg y Haldane.
* La anterior ecuación …
k1k2 EoS   k1k2 EoP
v
k1S   k2 P  k2  k1 
la “ecuación reversible general” de la ecuación
de velocidad de Michaelis-Menten.
Esta ecuación, respecto de las anteriores, presenta la ventaja de
que no se refiere a ningún tipo de mecanismo concreto, y puede
considerarse como puramente empírica.
De hecho existen mecanismos cinéticos mucho más complejos
que los que hemos considerado hasta ahora, y que conducen a
ecuaciones totalmente equivalentes a la que hemos obtenido más
arriba.
2. Relación de Haldane
Cuando una reacción química está en equilibrio, la velocidad de
reacción neta es cero, ya que la velocidad de formación () es
igual a la velocidad de descomposición (), y así, si
denominamos [Seq] y [Peq] a las concentraciones del S y del P en
el equilibrio, sustituyendo en la “ecuación reversible general”:
v
 
 
k S  k P  k  k 
k1k2 Eo Seq  k1k2 Eo Peq
1
eq
2
eq
Para que esta ec. sea = 0 basta con que:
2
1
(k1k2[Eo][Seq] – k-1k-2 [Eo][Peq]) = 0
reordenando,
obtenemos,
(k1k2[Eo][Seq] = k-1k-2 [Eo][Peq])
k1k2/k-1k-2 = [Eo][Peq]/[Eo][Seq]
k1k2/k-1k-2 = [Peq]/[Seq]
kcat
k1k2 k-1k2
KmP
k2
1
----------------- =
x ---------x -----k-1k-2 k-1k2
k-1
KmS
k-cat
kcat
k1k2 k-1k2
KmP
1
k2
----------------- = --------- x ---------x -----k-1k-2 k-1k2
KmS
k-1
k-cat
Luego,
k1k2/k-1k-2 = (kcat KmP)/(k-cat KmS) = [Peq]/ [Seq] = Keq
kcat KmP
---------------- = kespecif. x 1/k-especif. =[Peq]/ [Seq] = Keq
KmS k-cat
kespecif./k-especif. = Keq
Relación, muy importante en la cinética enzimática y que se
conoce como relación de Haldane.
Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir
de constantes cinéticas
* Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y
que contemple la formación de un sólo complejo intermedio.
* Para mecanismos más complejos, que contemplen la formación
de más de un complejo intermedio se obtienen relaciones más
complejas pero similares.
Relación de Haldane.
- La relación de Haldane nos permite obtener la constante de
equilibrio, Keq, de la reacción a partir de las constantes cinéticas .
Y por extensión, podemos, también calcular el valor de G’º de la
reacción a partir de las constantes cinéticas enzimáticas, ya que:
G’º = -RT ln Keq
Las constantes cinéticas son fáciles de calcular
experimentalmente.
3. Validez de la asunción del estado estacionario
En la deducción de la ecuación de Michaelis-Menten, hemos
supuesto que se “alcanzaba un estado estacionario”, en el que
d[ES]/dt = 0.
¿Lo aceptamos tal cual?
NO
k1
k2
E + S === ES --------- E + P
k-1
La ecuación:
d[ES]/dt = k1([Eo] – [ES])[S] – k-1[ES] – k2[ES]
es integrable por sí, si consideramos que [S] es constante.
NOTA: es instructivo intentar obtener una ecuación de velocidad
bajo estas condiciones, es decir, sin admitir la existencia de un
estado estacionario, sobre todo porque esto nos ayudará a
entender la validez de esta asunción.
d[ES]/k1[Eo][S] – (k1[S] + k-1 + k2)[ES] = dt
Resolviendo, obtenemos,
lnk 1EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES 
ta
 (k 1S   k  1  k 2)
Calculando el valor de la constante
a
lnk 1EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES 
lnk 1EoS 
t
 (k 1S   k  1  k 2)
 (k 1S   k  1  k 2)
, k 1EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES 
ln
lnk 1EoS 
t
 (k 1S   k  1  k 2)
 (k 1S   k  1  k 2)
que simplificando y reordenando nos da
lnk 1EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES   (k 1S   k  1  k 2)t  lnk 1EoS 
lnk 1EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES   lnk 1EoS   (k 1S   k  1  k 2)t

k EoS   (k 1S   k  1  k 2 ES 
ln
 (k 1S   k  1  k 2)t
k EoS 
1
1
Operando y tomando exponenciales a ambos lados, tendremos,
k EoS   (k1S   k  1  k 2 ES   e ( k1S k 1k 2)t
k EoS 
1
1
y resolviendo para [ES],
- ((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = -1 + e– (k1[S] + k-1 + k2)t
((k1[S] + k-1 + k2)[ES]/(k1[Eo][S])) = 1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t
(k1[S] + k-1 + k2)[ES] = (k1[Eo][S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t)

(k EoS )(1  e
ES  
1
 ( k1 S  k 1  k 2 ) t
(k 1S   k1  k2 )
)

La velocidad de reacción, como sabemos, viene dada por.
v= k2[ES]
- Sustituyendo,
v  k2 ES   k2
(k EoS )(1  e
1
 ( k1 S  k 1  k 2 ) t
(k 1S   k1  k2 )
v = k2[Eo] ((k1[S]) (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))/(k1[S] + k-1 + k2)
Y dividiendo por k1 numerador y denominador,
Vmax
k2[Eo] ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))
v = ---------------------------------------------[S] + (k-1 + k2)/ k1)
Km
)

Luego,
Vmax ([S] (1 - e– (k1[S] + k-1 + k2)t))
v = ---------------------------------------------[S] + Km
¿Qué hará falta para que esta ecuación sea igual a la que
obtuvimos a partir de la presunción de estado estacionario?
Cuando en esta ecuación, t se hace muy grande (t -> ), el
término exponencial tiende a e-, es decir a cero, y la ecuación
anterior se transforma en una ecuación exactamente igual a la
de Michaelis-Menten.
Ahora bien, el que el término exponencial pueda llegar a ser
despreciable dependerá también en gran parte del valor de (k1(S)
+ k-1 + k2), así pues,desde un punto de vista real, ¿cuánto tiene
que vale t para que esto se cumpla?
Un sencillo calculo, demuestra que para valores de t > 5 ms
(5 10-3 s)
El término exponencial tiene un valor < 0,01
Veámoslo,
Si admitimos para (k1(S) + k-1 + k2) un valor de 1000 s-1, valor por
otro lado razonable desde un punto de vista práctico, obtendremos:
-para t =4 ms -> e-4 = 0,018
-para t = 5ms -> e-5 = 0.007
* En otras palabras, tras unos pocos de milisegundos,
ambas ecuaciones son prácticamente indistinguibles
desde un punto de vista práctico.
En la deducción de esta última ecuación hemos supuesto que la
[S] era constante, lo que no es totalmente cierto, pues al
comenzar la reacción S comienza a consumirse.
Sin embargo, si partimos de una situación en la que [S] >> [Eo],
como generalmente hacemos cuando trabajamos en condiciones
de estado estacionario, la cantidad de S consumido durante el
tiempo en que tarda en alcanzarse el estado estacionario, es
insignificante, por lo que podemos despreciarlo sin miedo alguno
a cometer o introducir algún error o inexactitud.
RESUMEN
Con la condición de estado estacionario se pueden obtener una ecuación cinética que
describe los procesos enzimáticos reversibles
k1k2 EoS   k1k2 EoP
v
k1S   k2 P  k2  k1 
Se convierte en una ecuación cinética irreversible cuando se utilizan
concentraciones de Productos igual a cero
kespec
Relación de Haldane
kespec
 Keq
Permite conocer la constante de equilibrio de la reacción a partir de constantes
cinéticas Esta relación es válida para cualquier mecanismo reversible y que
contemple la formación de un sólo complejo intermedio
Se ha demostrado la validez del modelo del sistema estacionario