Transcript IDB HC1 en HC2

IDB HC3 en HC4
Enzymen en enzymkinetiek
Michaelis Menten
Inhibitie van enzymen
Ivo Horn
Te bestuderen
• Wilson and Walker, Principles and techniques of
biochemistry and molecular biology: blz 581-588
• Campbell and Farrell, 7e editie: H6, 6.1-6.7
optioneel:
• Campbell and Reece, 9e editie: H8: 8.4
Biologische katalyse
• Katalyse is de belangrijkste functie van eiwitten
• Katalyse: versnellen/efficienter laten verlopen van een
reactie
• Biologische katalytische eiwitten: enzymen
• Verhogen de snelheid 1020. niet-enzymen komen tot 104
• Er zijn enkele niet-eiwit katalytische biomoleculen:
ribozymen. Dit zijn katalytische RNA’s
Biologische wasmiddelen
• Bevatten enzymen
• Unilever research
• Hittebestendig maken van
eiwitten!
• Normale enzymen werken
optimaal bij 37 graden
Celsius
Een enzym betrokken bij ziekten
•
Het GTPase Ras is een
enzym
•
Zet GTP in GDP om
•
Verandert daarbij van
conformatie/vorm
•
De GTP –gebonden vorm is
aktief en geeft signalen door
in de cel
•
In bijvoorbeeld bepaalde
tumoren is Ras gemuteerd
en constant in de aktieve
conformatie
Acetylcholine esterase (ACE)
Bij Alzheimer: het enzym
acetylcholine esterase
wordt geremd waardoor
afbraak van acetylcholine
tegen wordt gegaan
Functies van eiwitten:
• Enzymen: versnellen reacties
• Structurele eiwitten: collageen (in bot) en
keratine (in haar)
• Opslag eiwitten: albumine (in bloed) en
caseïne (in melk)
• Transport eiwitten: Hb (O2 in bloed),
albumine (bili in bloed)
• Hormonale eiwitten: insuline, glucagon
• Receptor eiwitten
• Contractiele eiwitten in spierweefsel
• Defensieve eiwitten: antilichamen
PKMζ
Indeling van enzymen:
• Transferases (verplaatsen groepen op eiwitten)
• Hydrolases (maken water vrij)
• Ligases (“lijmen” DNA stukken aan elkaar)
• Kinases (fosforyleren eiwitten)
• GTPases (zetten GTP om in GDP)
• Fosforylases (verwijderen fosfaatgroepen)
• etc
geheugenfunctie
• PKMζ is betrokken bij geheugenvorming
• Muizen kregen saccharine toegediend
• Misselijkheid werd opgewekt direct daarna
• Reactie later op saccharine: misselijkheid (geheugen!)
• Injectie ZIP in de cortex, geen misselijkheid. Remming
enzym PKMζ
Voorbeeld groep 1
CH3CH2OH + NAD+  CH3CHO + NADH+ H+
ethanol
ethanal
Alcoholdehydrogenase (alcohol:NAD oxidoreductase)
Nummer 1.1.1.1 (EC-rules)
1.Hoofdgroep
1.CH-OH is donor
1.NAD+ of NADP+ is acceptor
1.Eerst gevonden enzym in deze groep
Verwijdert protonen en vormt daardoor ethanal uit
ethanol
Overzicht
• Katalytisch vermogen,specificiteit,
regulatie
• Introductie enzymkinetiek
• Kinetiek van enzym-gekatalyseerde
reacties
• Enzyminhibitie
• Ribozymen
Enzymen
• Enzymen laten cellen beschikken over het
vermogen om reacties zo snel te laten
verlopen als nodig is voor de cel
• Enzymen zijn de stoffen die gerelateerd
zijn aan een metabolische functie
Gekatalyseerde
reacties vergen
minder activatie
energie
De DG waarde
• Negatief: exergone reactie. Spontaan
verlopende reactie; er komt energie vrij
• Positief: endergone reactie. Reactie vraagt
energie om te verlopen. Energetisch dus
ongunstig
• Nul: exergoon noch endergoon. Evenwicht
situatie
De Gibbs vrije energie, DG
• DG = Gproducten – G reactanten
• DG is onafhankelijk van de gekozen route
• DG zegt niets over de snelheid van de reactie
• Indien negatief: dan kan de reactie plaats
vinden. Dat wil niet zeggen dat het merkbaar
of snel gebeurt!
Relatie tussen vrije energie en
evenwichtsconstante K
• DG = DG0 + RT ln K
• K is quotiënt van de concentraties reactanten
• K = [AB]/[A][B]
• R is de gasconstante
• DG0 is de standaard vrije energie (vaste waarde)
Allosterische enzymen:
sigmoidale curve
Allosterische enzymen
• Binden een bepaald molecule
• Veranderen dan van vorm
• Kunnen nu efficiënt aan substraat binden
• Hemoglobine kent een allosterisch effect
door zuurstof binding
Gekoppelde enzymatische reacties
Co-factoren, co-enzymen en
prostetische groep
• Veel enzymen hebben andere verbindingen nodig
• Zijn klein t.o.v. het eiwit
• Anorganisch: Co-factor
• Organisch:
– Covalent: prostetische groep
– Niet-covalent: co-enzym (vaak afgeleid van
vitamines)
Prosthetische groepen en cofactoren: zijn nodig
voor enzymatische activiteit
Katalytisch vermogen
• Enzymen kunnen reacties versnellen
tot 1016 x zo snel als nietgekatalyseerde reacties!
• Urease is een goed voorbeeld:
– gekatalyseerd: 3x104/sec
– Niet gekatalyseerd: 3x10-10/sec
– Ratio is 1x1014 !
Specificiteit
• Enzymen herkennen hun substraat
(substraat-specificiteit)
• Enzymen leveren een opbrengst van
meer dan 95% (reactiespecificiteit)
• Specificiteit wordt bepaald door de
unieke “fit” tussen het substraat en
het enzym
Enzymatische modellen
De cyclus van een enzym
Enzymatische werking
Schematisch de werking van een
enzym
Een voorbeeld van een
enzym
Wat enzymen doen....
• Enzymen versnellen reacties door
verlaging van de activeringsenergie
• Enzymen doen dit door de “transition
state” van de reactie beter te binden dan
het substraat
enzymreacties
Foutje in tekstboek: DP is niet negatief, want wordt gevormd!
Enzymreacties
k1
k2
E + S  ES  E + P
k-1
E is enzym
S is substraat
ES is het complex van E en S
P is product
k zijn snelheidsconstantes
K is (k-1 + k2) / k1
Verzadiging
Bij kleine hoeveelheid enzym t.o.v.
substraat
Enzym op maximale snelheid
Enzym kan niet sneller omzetten
Verzadiging van het enzym
Reactiesnelheid is afhankelijk van
de concentratie substraat
Bij hoge S concentraties nadert v
de Vmax waarde
Michaelis - Menten
Leonor Michaelis
Maud Menten
Michaelis Menten kinetiek
• De basis voor de meeste niet-allosterische
enzym-reacties
• Ontwikkeld in 1913
• Karakteriseert enzym-activiteit in termen van
snelheid en binding aan het substraat
Reactieschema
k1
k2
E + S  ES  E + P
k-1
Michaelis-Menten vergelijking
Michaelis-Menten's theorie
• Gaat uit van de vorming van een
enzymsubstraatcomplex
• ES is in een snel evenwicht met E en
S
• De reactie van ES naar E en P gaat
langzaam
Eerste orde kinetiek: er is een lineair verband
tussen enzymatische snelheid en substraat
concentratie
Michaelis-Menten mechanisme
snelheid vorming ES
= k1.[E].[S]
snelheid van afbraak van ES
= (k-1+k2).[ES]
a Km = [E].[S] = (k-1+k2)/k1
[ES]
Km = Michaelis-Menten constante
Michaelis-Menten –
vergelijking:
Vmax.[S]
v = ---------------Km + [S]
De Vmax
• Vmax is een “constante”
• Vmax is de theoretisch maximale snelheid van
de reactie
•
Vmax vereist dat alle enzymmoleculen aan het
substraat gebonden zijn
• Vmax wordt benaderd als de
substraatconcentratie hoog is
De steady state
• Er is weinig enzym-substraat complex
aanwezig
• Complex vorming en afbraak zijn in evenwicht
• Enzymen bereiken snel de steady state fase:
zijn efficiënt in het katalyseren van de reactie
Het turnover getal
Een maat voor de katalytische activiteit
• is het aantal substraatmoleculen omgezet in product
per enzymmolecuul per sec, als het enzym (E) is
verzadigd met substraat.
• k2 = kcat = Vmax/[Et]
• kcat varieert per enzym (minder dan 1/sec tot vele
miljoenen/sec
Enzymen beschrijven we middels
kcat en Km
De Michaelisconstante Km
• Km is een constante waarbij de Vmax
half-maximaal is
• Km is afgeleid van de reactiesnelheidconstanten
• Kleine Km: sterke binding; hoge Km:
zwakke binding
Bepaling Km
Lineaire Plot van
MichaelisMentenvergelijking
V0 = Vmax.[S]/(KM + [S])
Lineweaver-Burk: zet in reciproke vorm
1/V0 = (KM/Vmax).1/[S] + 1/Vmax
Vergelijk met : y = a.x + b
Door de Michaelis Menten
curve lineair te
Lineweaver-Burk-plot
maken zijn Km en Vmax eenvoudig te bepalen
Invloed pH
Invloed temperatuur
• Hogere temperatuur:
• Moleculen bewegen sneller
• Reactie verloopt sneller
 Te hoge temperatuur: enzym denatureert
Dus enzymen hebben een optimum
Invloed
temperatuur
b.v. Taq DNA polymerase
Enzym inhibitie
• Enzymen kunnen specifiek geremd worden
• Farma bedrijven proberen soms een miljoen “lead compounds”
• Uiteindelijk blijft er 1 over die precies past in het enzym en
specifiek de activiteit remt
• Ontwikkeling kost soms miljoenen euros
• Terugverdienen via octrooirecht op het uiteindelijke geneesmiddel
• Ethisch: derde wereld ziekten en ontwikkeling medicijnen
• Medicijnen zijn soms heel duur
Enzymremmers
Reversibel versus Irreversibel
• Reversibele inhibitors: niet-covalente
binding
• Irreversibele inhibitors: (bijna)
covalente binding
Remming van enzymen
•
Competitief - inhibitor (I) bindt aan actieve plaats
•
Niet-competitief- inhibitor (I) bindt elders
Competitieve remming
• Een remmer bindt op de plaats van het substraat
• Er is meer substraat nodig om de remming op te
heffen
• De Km wordt dus groter
Competitieve remming
Competitieve remming
Niet-competitieve
remming
Het enzym wordt ten dele geremd doordat
een remmer op een andere plaats bindt dan
het substraat, maar wel de katalyse beinvloed
Niet-competitieve remming
De Michaelis curve bij remming
Irreversibele remming
• Remmer bindt zeer sterk aan het enzym en
laat vrijwel niet meer los
• Zowel remmer als enzym gaan dus verloren in
het irreversibele complex
Enzymactiviteit
bepalen...Hoe?
Kies de
o de substraatconcentratie......?
o het substraat.....?
o de pH........?
o de aard van de buffer.....?
o de temperatuur.....?
Enzymactiviteit
bepalen...Waarom?
• Diagnostiek: veel eiwitten spelen een rol in medische
situaties
• Eiwitzuiveringen, isolaties, research
• Met hoeveel enzym(in Units) begin je?
• Hoeveel enzym (in Units) heb je nog over?
• Hoe zuiver (U/mg) is het?
Diagnostiek
Enzym
Normale
Waarden
(IU/l)
Verhoogd
wijst op
Creatinefosfokinase
40-240 (man)
40-200 (vrouw)
Hartinfarct
Alkalische
fosfatase
30-125
galstuwing
Zure fosfatase
 2,5
Prostaatcarcinoom
Lactaatdehydro- 200-450
genase
leverziekten
Waarom Units en geen
mol/l?
• Eiwitten ingewikkeld mengsel
• Eiwitten kunnen denatureren
Kijk daarom naar de activiteit van het
enzym!!!
1 I.U = die hoev.enzym die in staat is
om 1 mol substraat/min om te
zetten (onder bepaalde condities)
Voorbeeld enzymbepaling
• Zorg voor:
– Substraat met kleine KM, goede affiniteit
– Hoge [S]
– Optimale temperatuur
– Optimale pH
– Optimale buffer
En meet DA/min en activiteit enzym
Km en Kcat
• Belangrijkste parameters voor enzymen
• Hiermee karakteriseren we enzymen!
• Km: affiniteit voor substraat en = ½ Vmax
• Kcat: turnover getal, dus mate van katalytisch
vermogen ten opzichte van het substraat
Voorbeeld: enzym remming bij AIDS
• Tegen drie cruciale virale enzymen zijn remmers ontworpen
• De enzymen zijn “gekristalliseerd”, dwz, de structuur is
onderzocht en bekend
• Er zijn “gericht” medicijnen gemaakt tegen deze enzymen
Virale enzymen en AIDS
Anti-virale middelen en
enzymatische targeting
Samenvatting
• Enzymen zijn zeer efficiënte katalytische eiwitten
• Michaelis en Menten beschreven een zeer goed model voor niet-
allosterische enzym activiteit
• Uit een Michaelis Menten curve kan men de Km bepalen
• Kcat kan berekend worden uit de hoeveelheid gevormd product (is
k2)
• Enzymen kunnen competitief niet-competitief geremd worden
• Bij competitieve remming verandert de Km
• Bij niet-competitieve remming verandert de Vmax