Transcript b - materi-kuliah

Insert workgroup name on slide master
Insert workgroup
logo on slide master
Home
What’s New
Projects
Documents
KLT DENSITOMETER
Team
Links
ny Guntarti
FARMASI
2013
Insert workgroup name on slide master
Insert workgroup
logo on slide master
Home
What’s New
Projects
Documents
Team
Links
Kromatografi kertas
Insert workgroup name on slide master
Insert workgroup
logo on slide master
Home
What’s New
Projects
Documents
Team
Links
Kromatografi lapis tipis
KLT DENSITOMETER
 Metoda analisis instrumental yang
berdasarkan interaksi radiasi elektro
magnetik dengan analit yang merupakan
noda pada KLT
 Alat dilengkapi dengan spektrofotometer
yang mempunyai pancaran sinar yang
panjang gelombang diatur dari 200 - 700 nm.
 Uji kualitatif dan kuantitatif dengan sistem
absorbsi sinar atau emisi sinar (flouresensi)
Teknik penggunaannya :
- Pengukuran sinar yang diserap dan diteruskan
(hanya untuk TLC dengan pendukung gelas),
- Sinar yang diserap dan dipantulkan
- Atau sinar yang dipendarkan.
Susunan optik densitometer ini tidak banyak
berbeda dengan spektrofotometer tetapi pada
densitometer digunakan alat khusus reflection
photomultiplier, sebagai
pengganti photomultiplier pada
spektrofotometer.
55
Pada era perkembangan teknik kromatografi saat
ini pemakaian "Thin Layer Chromatograph
Scanner" yang lebih populer dengan nama
densitometer makin banyak dipakai .
66
lnteraksi radiasi elektrornagnetik dengan
noda pada KLT secara :
 Absorpsi
 Transmisi
 Pantulan (refleksi) pendar fluor
 Pemadaman pendar fluor
77
Sumber Radiasi
• Pada umumnya spektrofotodensitometer memberikan
rentang gelombang penentuan 200-630 nm.
• Lampu D2 (Deuterium) dipakai untuk pengukuran pada
daerah ultra violet dan lampu tungstein pengukuran
pada daerah sinar tampak.
• Untuk penentuan pendar fluor dan pemadaman pendar
fluor dipakai lampu busur Hg bertekanan tinggi.
• Pada densitometri juga dilakukan penentuan transmisi
atau absorpsi dan retleksi pada panjang gelombang
maksimal.
•
8
• Pada penentuan pendar fluor dan
pemadaman pendar fluor diukur pada
panjang gelombang dimana terjadi emisi atau
intensitas relatif pendar fluor yang optimal.
• Monokromator dipakai monokromator kisi
difraksi
• Detektor PMI' (Photo Multiplier Tube =
Tabung Penggandaan Foton) merupakan
detektor umum yang dipakai pada
densitometer.
9
 Densitometri diutamakan untuk analisis kuantitatif
analit-analit dengan kadar yang sangat kecil yang
yang merupakan hasil pemisahan dengan KL T.
 S.Levi dan Reisfeld telah mengangkat metode
densitometrik ke tingkat analisis kuantitatif
ultramikro. Keduanya telah berhasil meneliti
testosteron dalam cairan biologis pada rentang
kadar (1 hingga 250) ng, LSD dengan kadar (2150) ng, dan kholesterol (4 -150) ng dengan
pengukuran pendaran pada noda (kromatogram)
KLT.
10
10
Lanjutan
• Penentuan kadar analit yang dikorelasikan dengan area
noda pada KLT akan lebih terjamin kesahihannya
dibanding metode KCKT (Kromatografi Cair kinerja
Tinggi) atau KGC (Kromatografi Gas Cair). sebab area
noda kromatogram diukur pada posisi lurus atau "Zigzag" menyeluruh.
• Korelasi kadar analit pada noda kromatogram yang
dirajah terhadap area tidak menunjukkan garis lurus,
akan tetapi merupakan garis lengkung mendekati
parabola
11
11
Kurva hubungan serapan dan kadar
• Persamaan Kubelka-Munk
• Korelasi kadar analit yang dirajah terhadap area
kromatogram tidak merupakan garis lurus.
• Bila REM (Radiasi Elektro Magnetik) dengan
•
•
•
•
intensitas semula (I0) jatuh pada permukaan lapisan
tipis yang tidak homogen dengan arah rambatan
tegak lurus, maka sebagian dari REM tersebut akan:
direfleksikan (Is)
diserap oleh analit lapisan tipis (I)
diteruskan (It).
I=10 + Is + It
12
12
 Intensitas REM yang direfleksikan tergantung
pada koefisien permukaan lapis tipis (E), yang
dinyatakan sebagai :
 Is = I. E
 Harga E sangat dipengaruhi oleh jenis lapisan
tipis yang dipakai. Selanjutnya akan didapat :
 I0 =I-Is
 I0=I-I.E=(I-E)I
 Apabila lapisan tipis tersebut merupakan lapisan
tipis yang homogen maka akan berlaku hukum
Lambert Beer seperti pada spektrofotometri.
 It =I0. e-KX
13
13
E = koefisien permukaan lapis tipis
↓
It =I0. eHk. Lambeert Beer → It = I0 . e-kt
x
= tebal medium lapis tipis
k
= koefisien absorbsi
e-kt = berkurangnya I radiasi elektro magnetik
yang melewati medium → “ Optical density”
↓
Parameter S (koef. Penghamburan)
KX
 Oleh sehab itu pada metode spektrofoto-
densitometri dikenal parameter :
 K (koefisien absorbsi)
 S (koefisien penghamburan).
 Karena adanya parameter S inilah terjadi
penurunan intensitas radiasi yang masuk
medium lapis tipis yang dihamburkan oleh
partikel-partikel fase diam.
15
15
Parameter S (koef. Penghamburan)
Menyebabkan penurunan I radiasi yang
masuk ke medium lapis tipis
Sx = tiap pelat berbeda harganya
= 0 -10
dl = + (S + K ) I + S
- dx
j
dl
+ dx = - (S + K ) I + Sj
I = radiasi elektromagnetik yang arahnya tegak
lurus menuju permukaan lapis tipis
j = radiasi elektromagnetik yang arahnya
meninggalkan permukaan lapis tipis
S = faktor hamburan untuk tiap satu satuan
tebal lapis tipis
K = faktor penyerapan/absorpsi untuk tiap satu
satuan tebal lapis tipis
X = tebal lapisan untuk tiap satu satuan tebal
lapis tipis
Pernyataan Kubelkan – Munk :
( I – R )2
C
= E x
2R
S
E = absorbsi radiasi elektromagnetik oleh analit
pada pelat KLT
C = kadar analit
R = cahaya terpantul pada permukaan lempang
↓
Korelasi area analit dengan kadar dinyatakan
sebagai kurva parabola :
A2 = f ( C )
log A = f ( log C )
Bagan Alat densitometer
 Gambar
Densitometer
Double beam
Densitometer
Single beam
19
19
S
S
Mk
Mk
PM
PS
I
I
I
I
PM
PM
PM
Lempeng
T
Lempeng
(a)
(b)
Bagan konfigurasi densitometer cara sinar tunggal (a), ganda (b)
• Photomultiflier tersebut dapat memperbesar tenaga
beda potensial listrik sehingga mampu menggerakan
integrator.
• Integrator dengan sistem mikrokomputer secara
langsung dapat menghitung luas puncak atau
tinggi puncak secara otomatik. Selain itu mencatat
nomer urut, kedudukan puncak pada ordinal Y
atau waktu retensinya.
• Letak sumbu Y dan X dari lempeng akan
mempengaruhi hasil yang diperoleh.
• Kalau Y disesuaikan dengan arah gerak eluen dan
sumbuk X tegak lurus padanya atau merupakan
deretan penotolan sampel pada lempeng. Dengan
cara itu mereka akan mendekati kepastian.
22
22
Cara kerja pelacakan bercak Densitometer
• Gambar
7
3
2
5a 145
0,245
5b
1
4
6
Gambar Densitometer Model CS-930 Shimadzu, 1= pendukung
Lempeng. 2=Sistem optik (sinar). 3=Sumber sinar (UV/Visibel)
4= Tombol penggerak lempeng, 5a= Angka kedudukan lempeng (mm)
5b= angka serapan 6= Key Board, 7= kromatogram
23
23
Cara Kerja Densitometer
Lempeng yang telah digunakan untuk pemisahan.
diuji dulu kedudukan setiap bercak pada
sumbu(X,Y). agar sinar dapat tepat mengenai pusat
bercak.
• Setelah tombol dihidupkan lempeng ditempat
kan pada satu garis deretan Y, bercak diatur,
dan gerakan lempeng diatur sesuai kedudukan
bercak, menggunakan mikrokomputer.
• Panjang gelombang diprogram agar terjadi serapan
secara maksimum, bila belum diketahui dilakukan
24
scanning lebih dulu.
24
 Scanning pengujian kuantitatif ada 2 cara :
 A. Cara memanjang
 Sinar dilewatkan pada tengah bercak, sehingga
bercak hanya dideteksi sepanjang garis
tengahnya sepanjang sumbu Y,(Y1 sampai Y2).
Hasilnya baik bila bercak berbentuk bulat
semetris.
 B. Sistem zig-zag
 Sistem ini diprogram berjalan memanjang sumbu
Y tetapi berbelok -belok sampai garis tepi bercak
pada garis X, sehingga bergerak dari Y1-Y2, dan
X1-X2.
25
25
• Pelacakan bercak,
a
•
•
b
Gambar. Cara pelacakan bercak dengan TLC Scanner
(a) Model zig-zag. ( b). model lurus
Kelebihan penggunaan metode zig-zag lebih merata
pengukurannya, apalagi delta Y menggunakan jarak
terkecil.
• Kelemahannya waktu lebih lama, tetapi ketelitian
pengukuran lebih terjamin dibanding penggunaan
metode pengamatan lurus.
26
26
• Keterangan tambahan
• Besarnya bercak, dari X1 sampai X2 lebih besar
dari garis tengah bercak agar semua bercak
teruji.
• Delta Y, selisih garis kesatu dan kedua makin
kecil makin rata pengukurannya, antara 0,001
sampai 0,1 mm, kode yang diberikan angka 1
sampai dengan 3.
• Simbul Y tergantung dalam meletakkan lempeng
terhadap arah scanning, (lihat panah) sesuai
garis Y, dan garis tegak lurus Y adalah garis X.
27
27
• Perhitungan luas atau tinggi puncak sudah
dilakukan secara otomatis oleh alat, satuan luas
area (mikro volt) yang tertera merupakan
besaran puncak. Kadang-kadang prosentase
yang tertulis hanya merupakan kadar relatif dari
puncak yang muncul (tergambar).
• Dalam pengamatan lurus bila bercak nya tidak
semitris akan kurang teliti sebab konsentrasi
terbesar tidak selalu dilewati sinar pelacak
bercak.
• Penotolan dengan bercak kecil kemungkinan
molekul senyawa untuk mengumpul ditengah
lebih banyak.
28
28
Analisis Kualitatif
• Analisis kualitatif hanya dapat dibandingkan
Sinar mono
kromatis
`
Bercak
Intensitas Serapan
waktu retensinya, atau dilakukan penyarian dari
bercak setelah dielusi, dan kemudian diuji
secara spektroskopi.
• Tetapi adanya densitometer, spektrogramnya
dapat diuji.
Propil spektrogram
Panjang gelombang (nm)
29
29
Cara Menyari/ekstrasi
Bercak pada lempeng yang dilihat dibawah sinar
UV diberi tanda (lingkari) dengan ujung pensil,
kemudian diambil lapisan tipis bersama
bercaknya.
Lapisan yang diambil dimasukkan ke dalam gelas
piala, ditambah pelarut yang sesuai (etanol/
kloroform), diaduk, dan setelah larut, disaring.
Kedalam labu takar, dan cairan dijadikan volume
sampai tepat tanda ( 10,0 ml). Larutan siap diuji
dengan alat spektrofotometer.
30
• Larutan yang didapat diuji dengan spektrofotometer
pada panjang gelombang serapan maksimumnya.
• Karena pengenceran merupakan faktor penting
untuk perhitungan kadar senyawa yang diuji secara
kuantitatif segala caranya,
31
KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS (TLC)
Gambar Chamber yang banyak digunakan
Chamber
lempeng
32
*Chamber harus dijenuhkan dulu
selama lebih kurang 30 menit
dengan bantuan kertas saring.
*Penguapan dari fase gerak dari
permukaan lempeng, dalam
chamber yang tidak jenuh akan
menghasilkan Rf yang lebih besar,
reproducibility hasil keterulangan
Rf tak bagus dan permukaan fase
gerak akan konkap.
*Fase gerak yang tidak mau
campur dengan sempurna akan
menghasilkan chamber yang tidak
jenuh
33
Lempeng
 Lempeng HPTLC (High Performance Thin Layer
Chromatografi) atau KLTKT (kromatografi lapis tipis
Kinerja Tinggi) tidak dapat digunakan untuk preparatif
(butuh lempeng cukup banyak), maka hanya untuk
analisis kuantitatif
 Pelacak bercak untuk analisis kuantitatif dapat
digunakan densitometer baik menggunakan pereaksi
bercak lebih dulu maupun langsung menggunakan
pelacak sinar ultra ungu, sinar tampak maupun sinar
fluoresensi. (Didiskusikan tersendiri)
34
ALAT HPTLC= HIGH PERFORMANCE
THIN LAYER CHROMATOGRAPHY
 Penotolan
Pipa kapiler
Totolan
Totolan manual.
36
Chamber
Tempat elusi
Lempeng Silica gel
Bercak
Cairan elusi
37
JALANNYA SINAR (OTIK)
39
HASIL SCANNING SATU BERCAK
Scanning senyawa yang berbeda
Digunakan metode:
 Satu persatu dgn lambda serapan maksimumnya.
 Cara serentak, dgn menggunakan lambda yang
dapat dimiliki oleh semua senyawa.
Hasil Rekaman
 Hasil
 Scanning tiap bercak dengan lambda berbeda
45
 Scanning serentak beberap puncak/bercak
46
MENGHITUNG WAKTU RETENSI
Rf = a/c (cm)
b/c (cm)
 Contoh 1
 Analisis golongan tetrasiklin, dengan fase diam :
seluluse F, Fase gerak : larutan MgCl2 0,25 M.
(Nornendy, 1993).
Kromatogram tetrasiklin dan turunannya dilihat
dibawah sinar UV, 366 nm
1. Isotetrasiklin Rf =0,02 (coklat),
2. Anhidroterasiklin Rf=0,3(merah-ungu)
3. Terasiklin HCl Rf =0,73 (merah ungu)
49
49
H3C
CH3
N
H3C
8
9
CH3
7
6
5
4
D
C
B
A
10
11
12
1
TetrasiklinOH
OH
3
2
OH
C22H24N2O8
O
OH
O
O
C
sda
NH3
Klortetrasiklin
C22H23N2O8Cl
7-Cl
Oksitetrasiklin
C22H24N2O9
5-OH
Penjelasan Tetrasiklin
• Turunan tetrasiklin dapat membentuk khelat dengan
logam bervalensi +2 sehingga tidak akan baik bila
digunakan silika gel GF.
• Tetrasiklin dapat membentuk ikatan kompleks
dengan Ca++ sehingga tak dapat dielusi sempurna.
•
Bila digunakan selulusa sebagai fase diam, terdapat
batas kelarutan dalam selulusa, dan terjadi ikatan
hidrogen.
• Dengan eluen larutan MgCl2,tetrasiklin dapat
membentuk ikatan kompleks lebih baik dibanding
51
yang lain.
51
Struktur kimia
• Gambar
52
52
• Contoh 2.
Analisis zat warna lipstik, fase diam : silika gel,
fase gerak : campuran n-isopropil etilasetat dan
amoniak 10% (65:75:60) ( Wulan dkk, 1991)
Kromatogram zat warna lipstik
1. Tartasin Rf =0, 12 (merah muda)
2. Kuning AB Rf= 0,48 (kuning)
3. Kuning OB Rf =0,67 (kuning hijau)
4. Oranye I C, Rf=0,88 (putih)
5. Poncou SX, Rf=0,98 (kemerahan)
53
53
Penjelasan Zat Warna
• Berdasarkan kepolarannya adalah : tartrazin
poncou, oranye I, kuning AB, kuning OB (paling
kurang larut dalam air).
• Fase gerak berupa amoniak 10%, maka tartrazin
kurang larut dalam fase gerak, tetapi mudah larut
dalam pelarut organik. Tartrazin sifat base lebih
kuat, dari pancou sehingga paling lambat
migrasinya dalam suasana basa (amoniak 10%).
• Bila zat warna tidak discanner, tetapi bercak
disari kemudian diencerkan etanol sampai 5,0 ml.
Larutan yang didapat diuji dengan
spektrofotometer pada panjang gelombang
54
serapan maksimumnya:
54
Analisis Kuantitatif
• Analisis kuantitatif diperlukan senyawa baku
pembanding, dan dibuat kurva regresi linier.
• Untuk menguji tetrasiklin yang tidak mengalami
degradasi digunakan cara analisis dengan KLT
• Dibuat kurva baku hubungan kadar (mcg/ml) dan luas
puncak (mV).
•
•
•
•
•
•
•
Data Kadar Luas puncak
0,0 mcg
5 mcg
10 mcg
15 mcg
20 mcg
25 mcg
30 mcg
1,96 mV
8,5468 mV
13,6856 mV
19,0454 mV
23,9754 mV
29,356 mV
38,675 mV
53
Kurva regresi linier normal
Y= 2.396 X + 1.097
56
56
Aplikasi Garis regresi
 Persamaan kurva kromatogram yang didapat
pada pengamatan tetrasiklin mempunyai
persamaan regresi linier sebagai berikut:
 Y = 0,513 X + 1,487 , R- 0,9996
 Contoh menghitung:
 Misal luas puncak pada sampel 24,487 mV,
 Maka harga X :
 = (24,487-1,487): 0,513 = (23)70,513 =44,834 mcg/ ml
57
Untuk analisis kuantitatif zat watna tidak discanner
tetapi bercak disari kemudian diencerkan etanol,
dan diencerkan sampai 5,0 ml.
Cara penyarian, pemisahan dan pengenceran
harus optimal. Untuk membuat kurva baku
diperlukan lempeng yang besar untuk elusi
senyawa baku yang berbeda kadarnya.
58
Yang perlu Diperhatikan Dalam uji Kuantitatif
Hasil penelitian Rhodamin
a. Hasil Uji Kualitatif (benang wol)
No
Nama Sampel
Warna Benang Wol
Hasil
Uji
1
Kerupuk bunga
(tersanjung)
Merah muda
+
2
Kerupuk bawang
Tidak merah muda
-
3
Kerupuk ketela
Merah muda
+
4
Kerupuk rengginang
ketan
Tidak merah muda
-
5
Kerupuk rengginang
beras
Tidak merah muda
-
6
Kerupuk slondok
Tidak merah muda
+
7
Kerupuk unyil
Merah muda
+
8
Kerupuk taro
Tidak merah muda
-
9
Kerupuk lotek
Tidak merah muda
-
10
Kerupuk angin
Tidak merah muda
-
Hasil kromatogram uji kualitatif Rhodamin B pd UV 254 nm dan
366 nm
Hasil kromatogram uji kuantitatif UV 254 nm dan 366 nm
a. Kerupuk ketela
b. Kerupuk bunga (tersanjung)
c. Kerupuk unyil
A. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk ketela:
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)
Luas Area (milivolt)
0,005
0,7092
0,015
0,8493
0,030
0,8582
0,060
2,8790
0,090
3,2248
0,120
4,5278
2. Sampel kerupuk ketela
Replikasi
1
Luas area (milivolt)
1,3010
2
1,0251
3
1,1926
4
1,4120
5
1,2412
6
1,0307
7
0,7282
B. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk bunga
1. Standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)
Luas area (milivolt)
0,005
0,4425
0,015
1,1420
0,030
1,5273
0,060
3,0667
0,090
4,2450
0,120
5,1967
2. Sampel kerupuk bunga
Replikasi
1
Luas area (milivolt)
2,1328
2
1,7314
3
1,2856
4
1,4730
5
1,0555
6
1,0966
7
0,6985
C. Data Luas Area di bawah kurva kerupuk unyil
1. standar Rhodamin B
Kadar (mg/100ml)
Luas area (milivolt)
0,005
0,4865
0,015
0,9649
0,030
1,3910
0,060
1,6812
0,090
2,1991
0,120
2,2197
2. Sampel kerupuk unyil
Replikasi
1
Luas area (milivolt)
0,5340
2
0,7687
3
0,5636
4
0,5116
5
0,5502
Kesimpulan penggunaan HPTLC
a. HPTLC dapat digunakan untuk memisahkan dan
menganalisis campuran senyawa antara 20
sampai 30 senyawa.
b. Biaya pemeliharaan, operasinal, jauh lebih murah
dari HPLC.
c. Cara deteksinya bercak(senyawa) pada lempeng
lebih banyak pilihan dari HPLC walaupun dengan
pereaksi warna.
d. Pemisahan yang terjadi pada HPTLC lebih dari
10 menit, sedangkan HPLC mungkin lima menit
sudah selesai.
e. Ketilitian dan ketepatan mendekati HPLC.
66