Transcript FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分子靶点治疗中

FISH技术在肿瘤病理诊断及肿瘤分
子靶点治疗中的应用
王芳 邵建永
中山大学肿瘤防治中心
分子病理诊断实验室
Fluorescence in situ hybridization
（FISH）
 细胞遗传学技术
 原理：通过荧光标记的DNA探针与细胞核内的DNA
靶序列杂交
 观察：荧光显微镜
原位观察（细胞、组织）细胞核
彩色探针信号
 目的：获得细胞内多条染色体(或染色体片段)或多种
基因状态的信息。
用已知的标记单链核
酸为探针，按照碱基
互补的原则，与待检
材料中未知的单链核
酸进行异性结合，形
成可被检测的杂交双
链核酸。由于DNA分子
在染色体上是沿着染
色体纵轴呈线性排列，
因而可以探针直接与
染色体进行杂交从而
将特定的基因在染色
体上定位
原理
荧光标
记探针
探针变性
杂
交
样本DNA变性
FISH技术的特点
操作简便，探针标记后稳定，可与多种技术结合，
可成功地帮助细胞遗传学家做出回顾性分析
方法敏感，能迅速得到结果，24小时就可以完成检测
标本来源丰富，间期细胞，分裂中期细胞、分化或
未分化细胞及死亡或存活的细胞皆可以被检测
FISH探针的种类
telomere
subtelomere
CSP探针：染色
体着丝粒探针
GLP探针：位点
特异性探针
WPP探针：全染
色体或染色体区
域特异性探针
whole
chromosome
paint
centromere
locus
specific
操作流程简图
• 破坏细胞膜利于探针
制片
预处理
杂交。
• 蛋白酶消化、HCl处理
• 变性
结果分析
FISH
• 杂交
• 洗涤
• 复染
FISH技术在乳腺癌检测中的应用
乳腺癌 Her-2基因
 致癌基因：Her-2基因；
 位点：17q11.2-q12；
 编码蛋白：跨膜蛋白（与
表皮生长因子受体部分同
源）；
 25-30%乳腺癌病人都有
HER-2的扩增；
 HER-2基因扩增是决定
Herceptin治疗是否有效的关键
性指标。
Her-2基因的检测方法
检测方法
检测指标
优点
缺点
IHC
Her-2蛋白
费用低
光镜即可观察结果
准确性差，主
观性强，假阳
性率高
CISH
Her-2 DNA
光镜即可观察结果
对低度扩增及
染色体非整倍
扩增检测灵敏
度下降
FISH
Her-2 DNA
对于低倍、高倍染色
体非整倍性扩增检测
准确性高，灵敏度特
异性好，结果判断客
观
相对费用较高
Her-2基因FISH 探针组
疾病
名称
标记颜
检测探针
色
GLP
Her2 /
CSP17
红/绿
乳腺
癌
探针定位
探针名称
Her2：
17q11.2-q12
CSP17:
17p11.1q11.
1
CSP17:17号染
色体着丝粒
正常: 2红/2绿
异常: 红信号大于2为异常细胞(绿色信号不少于2
个的细胞)
DAPI染色后与HE切片对比图
导管内癌
观察浸润部分
结果判断
统计Ratio值（计数浸润性部分的20个细胞）
 Ratio值＝20个细胞核中红信号总数/绿信号总数
 Ratio＜1.8 为阴性结果
 Ratio＞2.2或众多信号连接成簇时可不计算为阳性结果
比值2～4为低度扩增
 4～10为中度扩增


>10为高度扩增
Ratio在1.8-2.2 之间时，则需要再计数20个细胞核中
的信号。如仍为临界值，则应在FISH检测报告中注明。
B
A
Her-2基因扩增状况
A. 无须计数的大簇团信号
（高度扩增）
B. 颗粒状信号（R>10，高度扩增）
C. 须计数的颗粒状信号
（R=3.5，低度扩增）
C
Her-2基因无扩增情况
红信号数>2，同时绿信号非整倍体
R<1.8，无扩增
红信号与绿信号
均为两点，R=1
荧光原位杂交与免疫组化检
测Her-2结果比较
我实验室已完成病例小结
IHC
FISH
0
1+
2+
3+
(n=15)
(n=5)
(n=14)
(n=29)
总数
（n=63）
无扩增
13
3
4
0
20
扩增
2
2
10
29
43
Her2表达IHC（2+）标本中，基因扩增率为71.41%
Her2表达IHC（3+）标本中，基因扩增率为100%
（文献报道：90-95%）
免疫组化（3+）与FISH对比图
×100
×40
>30%的肿瘤细胞全部
的细胞膜高强度着色
住院号：177319
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：+++
FISH：呈簇团状高度扩增
免疫组化（2+）与FISH对比图 1.
×40
>30%的肿瘤细胞全部
的细胞膜弱至中等着色
×100
住院号：175465
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：++
FISH：Ratio>5，中度扩增
免疫组化（2+）与FISH对比图 2.
×100
×40
>30%的肿瘤细胞全部
的细胞膜弱至中等着色
住院号：176921
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：++
FISH：Ratio＝1.45，无扩增
免疫组化（1+）与FISH对比图1
×100
×40
>30%的肿瘤细胞弱的着色
住院号：175689
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：+
FISH： Ratio＝1.62，无扩增
免疫组化（1+）与FISH对比图2
×100
×40
住院号：175895
>30%的肿瘤细胞弱的着色
浸润性导管癌Ⅲ级
IHC：+
FISH：簇状扩增
免疫组化（－）与FISH对比图1
×40
×100
住院号：176846
<30%的肿瘤细胞弱的着色或不着色
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：－
FISH： Ratio＝1.02， Her2基因无扩增
免疫组化（－）与FISH对比图2
×100
×40
肿瘤细胞不着色
住院号：175472
浸润性导管癌Ⅱ级
IHC：－
FISH：呈簇状扩增
评价17号染色体的意义
 17号染色体非整倍性：每个细胞中17号染色体多于或少
于2个；
 乳腺癌遗传学特征之一，可能预示预后不良；
 17号染色体多体性是导致IHC 3+但FISH检测为阴性的
主要原因；
 我实验室完成病例中17号染色体非整倍性发生率为
33.3%。
评价Her-2基因状态的同时应考虑
17号染色体数目的变化
IHC与FISH结果不一致原因分析
 IHC判断标准的主观性
 内对照探针——17号染色体着丝粒探针的建立，
排除IHC假阴性
 IHC 2+及3+的基因检测结果分离，无法控制
• 由于17号染色体多体性造成假性扩增
• IHC自身无法克服的缺陷
基因扩增是Herceptin
使用的关键性指标
Her2基因
检测流程
石蜡组织标本
IHC检测
—
1+
FISH检测
2+
3+
+
再用FISH
方法检测
—
再用FISH
方法检测
+
+
Herceptin治疗
Herceptin治疗
—
HER2 FISH
乳
腺
癌
检
测
报
告
模
板
FISH技术检测染色体易位
在淋巴瘤分型中的应用
淋巴瘤的诊断与分型
HE＋IHC + cytogenesis = 解决!
不同类型的淋巴瘤有各自不同的染色体易位
使控制细胞发育分化过程中的关键蛋白失活
与淋巴瘤的发生密切相关
目前开展的染色体易位检测（6种）：
•
IGH/BCL2 t (14;18) (q32;q21) 染色体易位
•
IGH/MYC t (8;14) (q24;q32) 染色体易位
•
IGH/CCND1 t(11; 14)(q13; q32) 染色体易位
•
API2/MALT1 t(11;18)(q21;q21)染色体易位
•
IGH/MALT1 t (14;18) (q32;q21)染色体易位
•
BCR/ABL t(9;22)染色体易位【费城染色体】
t (14;18) (q32;q21) 染色体易位
意义：

t (14;18)易位后形成的IGH/BCL2基因能编码完整BCL2
蛋白，IGH基因附近的增强子使BCL2 过表达
 t (14;18)为FL的标志（低级别更易出现）,检出率达93%～100%
 DLBCL 20% ～ 30%出现易位
影响检出率的原因：

石蜡标本中DNA的降解
 FL3b接近DLBCL，其易位率低，影响总体检出率
IGH/BCL2 Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe
14q32 region
J region
C region
V region
5
3
18q21 region
MCR MBR
3
探针杂交示意图
细胞核IGH/BCL2双色双融合
易位探针杂交后显示2O2G信号
肿瘤细胞核IGH/BCL2 双色双融合
易位探针杂交后显示1O1G2F信号
检测探针
标记颜色
IGH / BCL2
green/orange
探针定位
IGH: 14q32
BCL2: 18q21
正常: 2O/2G
异常: 1O/1G/1F
阳性标准: >7%的细胞出现黄色融合信号
4×
40×
病例1：会诊84363，男，74y

腹腔肿物；
FISH：54%的细胞可见融合
信号；


100×
诊断：FLⅡ~Ⅲ。
IHC:BCL2
40×
病例2：会诊84362，女、36
 颈部肿物
 抗炎治疗后（出现变性坏死）
诊断：DLBCL
 FISH：阳性，10%的细胞可见
融合信号

100×
t (8;14) (q24;q32) 染色体易位
意义：

t (8;14)易位后形成的IGH/MYC基因能编码完整MYC蛋
白，IGH基因附近的增强子使MYC过表达
应用范围：
 所有Burkitt淋巴瘤都有t (8;14)易位
 诊断不典型Burkitt淋巴瘤须有t (8;14)易位的MYC异常
可见于继发于滤泡性淋巴瘤的前驱B淋巴母细胞白血病/
淋巴瘤
IGH/MYC, CEP8 Tri Color, Dual Fusion Translocation Probe
14q32 region
V region
V region
C
C region
region
8q24 region
MYC
探针杂交示意图
正常细胞核IGH/MYC, CEP8 三色双融
合易位探针杂交后显示2R2G2A信号
肿瘤细胞核IGH/MYC 双色双融合
易位探针杂交后显示1O1G2F信号
检测探针
标记颜色
LSI IGH
green
14q32
LSI MYC
orange
8q24
CEP 8
aqua
正常:2G/2O/2A
异常:1G/1R/2F/1A或>2A
探针定位
8p11.1-q11.1
40×
10×
病例3: 399318，女、5y

颈淋巴结活检；

ISH: EBERs（+）；
FISH:45%的细胞可见融
合信号；


诊断：散发性经典型BL。
40×
4×
病例4: 405618，女，21y


盆腔肿物穿刺；
ISH: EBERs（+）；
FISH: 23%的细胞可见融合信
号；

诊断：考虑为散发性经典型
BL。

活检穿刺标本
40×
4×
病例5:399625，男、42y

ISH:EBERs（-）；

经多学科大会诊；
诊断：较符合散发性非
典型BL；

FISH: 25%的细胞可见
活检穿刺标本
融合信号；

t (11; 14)(q13; q32) 染色体易位
意义

t (11;14)易位后形成IGH/CCND1基因，IgH基因附近的增
强子使 Cyclin D1过表达
应用范围
 套细胞淋巴瘤的诊断性指标
 也出现过零星其它淋巴瘤t (11;14)易位的检出
IGH/CCND1Dual Color, Dual Fusion Translocation Probe
14q32 region
J chain
C region
V region
11q13 region
简洁示意图
探针杂交示意图
细胞核IGH/CCND1双色双融合
易位探针杂交后显示2R2G信号
检测探针
IGH/CCND1
正常: 2O/2G
异常: 1O/1G/2F
肿瘤细胞核IGH/CCND1双色双融
合易位探针杂交后显示1R1G2F信号
标记颜色
green/orange
探针定位
IGH: 14q32
CCND1: 11q13
40×
10×
病例6: 393301，男，40y；
 肘部肿物；
IHC：CyclinD1弱阳性；
 经科内会诊；
 FISH:21%的细胞可见融合
信号；

IHC:CyclinD1

诊断：MCL
所示箭头为染色体易位
产生的融合信号（×100）
10×
40×
形态不典型+IHC不理想
病例7: 386766，女，67y

扁桃体活检2块，直径0.3CM

IHC：CyclinD1弱阳性；

FISH:45%的细胞可见融合信号；
诊断：不排除MCL的可能，重取
活检；

CyclinD1
所示箭头为染色体易位产生的融合
信号（×100）
FISH检测标本要求
• 新鲜活检或手术切除标本；
• 石蜡包埋组织或石蜡切片（3－5um）；
• 肿瘤穿刺活检组织或细胞涂片；
• 骨髓穿刺组织尽量送涂片，不用活检组织（因为
脱钙需要使用盐酸，破坏DNA）；
• 肿瘤细胞阳性的胸腹水涂片；
• 一般在3个工作日后可以发出检测报告；
EBV-DNA定量PCR结果的稳定
性分析
EBV-DNA定量PCR标准样品扩增曲线
107
106
105
104
鼻咽癌检测结果比较
• 5个不同样品重复检测；
• 扩增可靠性99.4%；
• 每个样品同时进行5次
重复，结果重复性很
好；
• 同时扩增，结果存在
显著差异的为8％；
• 不同时间扩增，结果
存在显著差异的为6.7
％。
Sample Name
Quantity
Final results
080716EB05
0
0.00
080716EB05
10.341734
827.34
080716EB05
0
0.00
080716EB05
0
0.00
080716EB05
0
0.00
138 ± 370 (268%)
5个样品，每个样品分5
管抽提DNA后，同时进
行定量PCR检测结果
080716EB08
7000.5225
560041.80
080716EB08
5419.455
433556.40
080716EB06
95.42204
7633.76
080716EB06
88.19726
7055.78
080716EB08
5733.5117
458680.94
080716EB06
109.359375
8748.75
080716EB08
6236.7397
498939.18
080716EB06
22.78165
1822.53
080716EB08
6214.828
497186.24
080716EB06
95.40062
7632.05
6579 ± 2729 (41%)
080716EB07
1509.159
120732.72
080716EB07
1006.95605
80556.48
080716EB07
1107.8715
88629.72
080716EB07
1026.4144
82113.15
080716EB07
786.2834
62902.67
86987 ± 21134 (24%)
489681 ± 47968 (10%)
080716EB09
36678.547
2934283.76
080716EB09
52022.11
4161768.80
080716EB09
41255.816
3300465.28
080716EB09
40550.97
3244077.60
080716EB09
37981.715
3038537.20
3335827 ± 485146 (14%)
14
12
DNA 拷贝数
10
8
6
4
2
0
A
× 10²
B
C
× 103
× 104
D
× 105
E
× 106
5个样品，每个
样品分3管，在
不同时间（相
隔一个星期）
分别抽提DNA后，
进行定量PCR检
测结果
Sample Name Quantity
Final results
080716EB05 45.632095
3650.57
080716EB06
78.58184
6286.55
080716EB07
1104.825
88386.00
080716EB08 6099.1826
487934.61
080716EB09 34647.082 2771766.56
080716EB05
080716EB06
080716EB07
080716EB08
080716EB09
0
38.885056
1163.3236
5720.7812
46489.215
0.00
3110.80
93065.89
457662.50
3719137.20
080716EB05
080716EB06
080716EB07
080716EB08
080716EB09
7.594282
78.94603
665.7312
3822.3396
29358.242
607.54
6315.68
53258.50
305787.17
2348659.36
5个样品，每个样品分3管，在不同时间（相隔一个星期）
分别抽提DNA后，进行定量PCR检测结果
10
第一次
第二次
第三次
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
A
× 103
B
× 103
C
D
E
× 104
× 105
× 106
Thank you for your attention!!