Transcript Diapositive 1

Master "Ingénierie pour la Santé"
Option "Ingénierie Médicale"
Culture de cellules animales
Sophie PINEL
Laboratoire d’Histopathologie Expérimentale et Moléculaire – EA 4001
Faculté de Médecine, Bât D 1er étage
9 avenue de la Forêt de Haye
54505 VANDIEUVRE LES NANCY
Tél : 03.83.68.32.04.
Email : [email protected]
INTRODUCTION GENERALE
Modèles d’études en biologie animale (≠ biologie végétale)
COMPLEXITE
+
-
Organisme entier
Homme
Relations
intersystèmes
Animal
Organe isolé
Environnement artificiel
pour croissance et/ou
fonction
Cellules en culture
Liens intercellulaires
normaux rompus
Homogénéité
Fractions
cellulaires isolées
(Fractions subcellulaires,
macromolécules)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1. DIFFERENTS TYPES DE CULTURES CELLULAIRES
1.1. Méthodes d’obtention des cellules cultivées
 Achat auprès d’un organisme certifié
American Type Culture Collection (ATCC)
European Collection of Cell Cultures (ECACC)
Monoclonal avec caractéristiques définies, qualité contrôlée mais onéreux
 Echanges entre laboratoires
Qualité non garantie : risques de contamination ++
 Isolement à partir d’un liquide ou d’un tissu biologique
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.2. Cultures primaires – Cultures secondaires
1.2.1. Cultures primaires
Isolement à partir d’un liquide biologique
Cellules circulantes
Sang : lymphocytes, cellules leucémiques
Liquide pleural, liquide d’ascite : cellules tumorales
Centrifugation sur gradient de densité, ou trieur de cellule
Isolement à partir d’un organe ou d’un tissu
Cellules adhérentes
Culture d’explants
Fragment d’organe/de tissu
Après quelques jours
Milieu de culture adapté
Dissociation mécanique et enzymatique
Action mécanique (broyer, émincer)
Action d’enzymes protéolytiques
(trypsine, collagénase)
Suspension cellulaire
Plusieurs types cellulaires
(fibroblastes dominants)
Mise en culture
Purifier pour système monoclonal
Méthodes de clonage
Méthodes de séparation physique
(centrifugation sur gradient de densité, chromatographie d’affinité, cytométrie de flux,
électrophorèse, séparation par billes magnétiques)
1.2.2. Cultures secondaires
Cultures établies par repiquage successifs de cellules déjà mises en
culture (cultures primaires ou secondaires, cellules achetées, …)
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.3. Cultures finies – Cultures continues
1.3.1. Cultures finies
Cultures cellulaires à durée de vie limitée
Après X repiquages (env. 30 à 60 mitoses/divisions), division
cellulaire stoppée, mort cellulaire par apoptose
Cellules somatiques issues de tissus normaux
1.3.2. Cultures continues
Cellules en cultures capables de se diviser indéfiniment
Cellules ayant des propriétés d’IMMORTALITE
Immortalité innée : cellules souches
Immortalité acquise : CELLULES TRANSFORMEES
= cellules tumorales
Cultures primaires puis secondaires à partir d’une
tumeur animale ou humaine
Cultures primaires puis secondaires à partir d’un
tissu normal : transformation in vitro (agents
chimiques, radiations, virus)
(+) : Culture illimitée dans le temps, manipulation plus facile et croissance plus rapide
( -) : instabilité génomique, pertes des propriétés morphologiques et fonctionnelles initiales
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension
1.4.1. Cellules adhérentes
Dépendance vis-à-vis de l’ancrage
= Nécessité d’être attachées entre elles et ancrées sur un support pour survivre
Cellules issues de tissus normaux, la plupart des cellules issues de tumeurs solides.
Cultures en monocouche
Ensemencement dans des boîtes de culture : les cellules adhèrent au
fond, puis se divisent, se placent les une à côté des autres jusqu’à former
un tapis cellulaire.
Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits
Cultures tridimentionnelles = sphéroïdes
Cellules mises en culture en suspension dans le milieu et maintenues
sous agitation lente afin de favoriser l’accrochage des cellules entre elles:
formation d’amas sphériques au sein desquels les cellules se divisent
Spinner
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.4. Cellules adhérentes – Cellules en suspension (suite)
1.4.2. Cellules en suspension
Indépendance vis-à-vis de l’ancrage
Ex : Cellules issues du sang, cellules leucémiques
Cellules mises en culture en suspension dans le milieu de culture (avec
ou sans agitation) et se multiplient ainsi
Boîte de Pétri, Flacon de culture, Plaques multipuits
Remarque :
Récipients en verre
Récipients en plastique +/- pré-traitement
Systèmes matriciels simulant la matrice extracellulaire
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.5. Types cellulaires cultivés
Identification par rapport au système dont les cellules dérivent
Caractéristiques morphologiques
+/- conservées
Caractéristiques fonctionnelles
Rque : Influence des conditions de culture
Cellules de type lymphoblastique
En suspension, forme sphérique
Cellules de type épithélial
Ancrage indispensable, polygonales, et
aplaties, très serrées
Cellules de type fibroblastique
Ancrage indispensable, allongées et
bipolaires, filaments
Cellules de type endothélial
Ancrage indispensable, polygonales,
petite taille
Cellules de type neuronal
Ancrage indispensable, un corps
central et départ de dendrites
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
1.5. Types cellulaires cultivés (suite)
Hybridomes
Cellules hybrides obtenues par fusion de deux cellules
appartenant à des types différents mais apparentés
Intérêt : Combiner les propriétés des 2 types cellulaires
Ex : Lymphocyte issu de la rate capable de produire un anticorps défini
+
Cellules de myélome se divisant très rapidement et possédant la machinerie
pour produire des anticorps mais l’utilisant pas
=
Hybridome capable de produire un très grande quantité de l’anticorps désiré
Intérêt industriel, diagnostique et clinique
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
2. CROISSANCE DES CELLULES EN CULTURE IN VITRO
2.1. Le repiquage des cultures cellulaires
Lavage du tapis cellulaire (PBS)
Détachement des cellules par action enzymatique (trypsine,
collagénase à 4° ou à 37°C)
2.2. Les différentes phases de la croissance
1 : phase de latence,
2 : phase de croissance exponentielle,
3 : phase de ralentissement,
4 : phase stationnaire,
5 : phase de déclin.
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
2.3. Cryoconservation des cellules
Cellules peuvent être congelées
Éviter les passages trop nombreux = vieillissement de la
population cellulaire
Permet d’interrompre l’activité
Cryoconservateur : DMSO, glycérol
Azote liquide
Descente progressive en température
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3. CONDITIONS ET DIFFICULTES DE LA CULTURE CELLULAIRE
3.1. Eviter les contaminations
3.1.1. Contaminations chimiques
Endotoxines, résidus plastiques, ions métalliques,
traces d’agents nettoyants/désinfectants, etc…
Effets invisibles, produits difficiles à détecter
3.1.2. Contaminations biologiques
Levures, bactéries, champignons
Effets généralement visibles,
facile à détecter
Modification du pH
et de la turbidité du
milieu
Virus, mycoplasme
Effets invisibles, détection possible par analyse spécifique
Détection de mycoplasme : marquage de l’ADN des cellules avec du Hoechst
Négatif
Positif
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.1.3. Moyens de lutte contre les contaminations
Environnement et surfaces propres
Consommable utilisé adapté (fournisseur certifié)
Equipement, récipients plastiques et verre propres et stérilisés
Milieux de culture stériles
Usage d’antibiotiques, d’antifongiques
Maintenir la stérilité des cultures et des milieux
HOTTE A FLUX LAMINAIRE VERTICAL
ou
POSTE DE SECURITE MICROBIOLOGIQUE
Filtre HEPA (high efficiency particule air)
Protection des cultures, milieux, plastiques
Protection de l’environnement
Protection du manipulateur (vitre à l’avant))
Lampe UV
Air ambiant
Air contaminé
Air stérile
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.2. Trouver les conditions de culture optimales
3.2.1. Critères de jugement
les cellules ne meurent pas
obligatoires
les cellules se divisent
Environnement optimal
les cellules reproduisent in vitro les
fonctions physiologiques ou
biochimiques connues in vivo
Les critères d’évaluation
Viabilité cellulaire
Taux de croissance
Microscope en phase inversée, bleu trypan,
numération à l’hémocytomètre
Morphologie
Efficacité d’ensemencement (dilution de la culture et formation de colonie)
Expression de fonctions spécifiques
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
3.2. Trouver les conditions de culture optimales (suite)
3.2.2. Paramètres de l’environnement à contrôler
Le milieu de culture
Milieux complexes qui doivent apporter tous les éléments nutritifs
nécessaires à la croissance/prolifération des cellules animales
Eau
Ions minéraux nombreux et variés en concentration adéquate
(Na+, K+, Cl-,HCO3-, H2PO42-)
Source de carbone et d’énergie : le plus souvent glucose
Eléments de constitution :
acide aminés essentiels +/- non essentiels, + glutamine
acides gras, cholestérol,
vitamines + cofacteurs,
riboses et désoxyribose
Facteurs de croissances divers
(FGF, EGF, PDGF, IL-2, etc…)
Sérum de veau fœtal (1,5 à
10%) décomplémenté
Antibiotiques +/- antifongiques : pénicilline G, streptomycine, +/- amphotéricine B
GAZ : O2 et CO2
Les paramètres physico-chimiques
Osmolarité avoisinant celle du sérum
physiologique (300 mOsm/L)
Rôle des ions, contrôle les
mouvements d’eau et de substances
entre milieux extra et intra-cellulaire
pH compris entre 7,0 et 7,4
En particulier HCO3-/CO2, système tampon
Température : 37°C
Hygrométrie : 80% d’humidité
Eviter évaporation du milieu
INCUBATEUR A CO2
Contrôle de la température,
hygrométrie, 5% de CO2
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
4. DOMAINES D’APPLICATION
Culture cellulaire = Outil majeur en biologie animale
4.1. Modèle d’étude
Etude des propriétés biologiques et biochimiques des cellules
Etude des liens entre les causes d’une maladie/anomalie et ses répercussions sur la
cellule
Etude des effets d’un agent chimique sur les cellules
Etude du processus de vieillissement cellulaire +/- comment interagir
Etude nutritionnelle
4.2. Support aux tests de toxicité
Etude des conséquences toxiques d’un nouvel agents chimiques,
cosmétiques, pharmaceutiques
Cellules hépatiques et rénales
En aval des essais chez les animaux
4.3. Recherche en cancérologie
Différence entre cellules normales et tumorales
Etude des agents transformants = cancérigènes
Screening de nouveaux médicaments anticancéreux
CULTURE DE CELLULES ANIMALES
4.4. Virologie
Etude de la réplication et des propriétés des virus .
Etude des mécanismes d’infection par les virus
Etude de l’efficacité des antiviraux
4.5. Applications industrielles
Production d’anticorps monoclonaux (diagnostic, clinique, recherche)
Production de protéines de synthèse (insuline, facteur de croissance)
Production de virus en grande quantité pour préparation des vaccins
4.6. Etudes génétiques
Analyses diagnostiques sur le caryotype, les chromosomes, l’ADN
4.7. Génie génétique, thérapie cellulaire et thérapie génique
Introduction de gènes dans les cellules pour en modifier les propriétés d’expression
(recherche, application clinique ?)
Production de tissus de substitution : thérapie cellulaire (cornée, peau) +/- essais !!!
Réintroduction de gènes fonctionnels dans les cellules à visée thérapeutique