DIAGNOSTICA DELL’EMOFILIA ACQUISITA

Serena Torre

Laboratorio di Emostasi e Trombosi Ospedale San Giovanni Bosco

SINDROMI “EMORRAGICHE” ACQUISITE da AUTOANTICORPI

S. dell’emofilia acquisita Fattore VIII S. di von Willebrand acquisita Fattore von Willebrand Altri deficit acquisiti Fattore IX, V, VII, da autoanticorpi XI, XIII

EMOFILIA ACQUISITA

 Patologia emorragica “acquisita” rara  Incidenza: 0.2 - 1.0 caso/milione/anno  Distribuzione bifasica dell’età di insorgenza con picchi tra 20-30 e 60-80 anni  Quadro clinico dominato spesso da emorragie gravi  Mortalità fino al 22% in diverse casistiche

CONDIZIONI CLINICHE SPESSO ASSOCIATE A EMOFILIA ACQUISITA Malattie autoimmuni/ Malattie a base immunologica Reazioni farmacologiche Interventi chirurgici Gravidanza/Periodo peri/post-partum

A. Reumatoide/ LES/ Arterite temporale/ Colite ulcerosa/ Dermatomiositi/ Polimiositi/ Miastenia grave /Sclerosi multipla/ Asma/ Penfigo/ Dermatosi aspecifica/GVHD/Sclerosi multipla Penicillina/ Ampicillina/ Cloramfenicolo/ Fenintoina ed altri anticonvulsivanti / Sulfonamide/ Interferone α /Fludarabina

Neoplasie

Tumori Solidi (prostata, polmone)/ Emopatie maligne (leucemia linfatica cronica, linfoma)

SPECIFICITÀ EPITOPICA DEGLI AUTOANTICORPI

Più frequentemente gli autoanticorpi riconoscono epitopi localizzati tra gli aa 454-509 e 593 del dominio A2 , 1804 1819 del dominio A3 , 2181-2243 del dominio C2

MECCANISMO D’ INIBIZIONE

Anti-C2

vWF : inibiscono il legame del FVIII ai PL e possono interferire con il legame al

Anti-A2 e Anti-A3

: impediscono il legame con il FIX e il FX

ALLOANTICORPI (Emofilia) AUTOANTICORPI (Emofilia Acquisita)

 Diretti contro più epitopi  Inibizione FVIII con cinetica di Tipo I

(lineare)

 Diretti contro un unico epitopo  Inibizione FVIII con cinetica di Tipo II

(complessa)

CINETICHE DI INATTIVAZIONE DEL FVIII

Boggio NL. Rev Clin Exp Haematol 2001

CARDINI DIAGNOSTICI

     Anamnesi negativa per precedente diatesi emorragica PT normale Normale conta piastrinica aPTT allungato non corretto dall’aggiunta di un eguale volume di plasma normale ( test di miscela ) Bassi livelli di FVIII

aPTT: TEST di MISCELA

Plasma del paziente Plasma normale

miscela 1:1

aPTT incubazione a 37

°

C

VALUTAZIONE DEL TEST DELLA MISCELA

    

Secondi

M- N < 5 s : corregge. M- N 

Ratio M/N

< 1.20: corregge. 

Indice di Rosner (ICA)

5 s : non corregge.

1.20: non corregge.

< 15% corregge.  = (M - N/P) x 100 15% non corregge.

% di correzione = (P-M)/(P-N) x 100 > 70% corregge. < 58% non corregge.

% di correzione = (P-M 4:1)/(P-N) x 100 Immediato:  50% corregge. < 50% non corregge.

Incubato: > 10% corregge. (100% Sens. e Spec.) Chang S. Am J Clin Pathol 2002

DIAGNOSI DI LABORATORIO

Test aPTT della miscela aPTT mix allungato: presenza di inibitori Dosaggio FVIII, FIX,FXI,FXII Un fattore ridotto Più fattori ridotti Ricerca inibitore specifico (metodo Bethesda) Ricerca LAC aPTT mix normale: carenza di fattori Dosaggio FVIII, FIX, FXI, FXII, Carenza di un fattore

DOSAGGIO DELL’INIBITORE: principio

Il test viene eseguito creando miscele (in parti uguali) di un pool di plasma normale con il plasma del paziente ( mix da testare ) ( e di un pool di plasma normale con tampone imidazolo a pH 7.4 mix di controllo ) Dopo 2h di incubazione a 37 determina ° C, viene determinata la percentuale relativa di attività di FVIII della mix da testare che, rapportata a quella della mix di controllo, l’attività residua di FVIII .

Si possono esaminare solo campioni privi di attività FVIII.

DOSAGGIO DELL’INIBITORE: materiali

•Plasma citratato ( può essere congelato) •Plasma normale di riferimento ( pool di plasma normale) •Tampone Imidazolo 0.1M, pH 7.4

•Reagenti per il dosaggio fattori, metodo ad un tempo

METODO BETHESDA-NIJMEGEN

Limiti del metodo Bethesda:

 Numerosi falsi positivi per valori vicino al cut off di consenso (BU < 0.5/ml) 

bassa specificità

– Aumento del pH nella miscela da testare 

Inattivazione del FVIII

– Diminuzione della concentrazione proteica nella miscela da testare 

Inattivazione del FVIII

METODO BETHESDA-NIJMEGEN

Plasma del paziente Plasma normale tamponato a pH 7.4

50/50 mix Incubare 2h 37 ° C Plasma carente di FVIII Miscela da testare

Dosaggio del FVIII

Miscela di controllo

Giles A.R. Thromb Haemost 1998

DEFINIZIONE DI UNITÀ NIJMEGEN-BETHESDA PNP FVIII 100% Miscela isovol. Paziente/PNP FVIII 50%

Plasma del Paziente

PNP pool

1 Unità Bethesda-Nijmegen è pari alla quantità di inibitore in grado di inattivare il 50 % di FVIII di un pool di riferimento, dopo 2 h di incubazione.

Attività residua = x 100 FVIII miscela di controllo IN BASE ALLA DEFINIZIONE DI UNITA’ DI INIBITORE SI COSTRUISCE UNA TABELLA DI CONVERSIONE TRA: FVIII RESIDUO % e U. DI INIBITORE per mL di plasma

CURVA DI CONVERSIONE

55 50 45 15 10 5 0 40 35 30 25 20 0 A S S E N T 18% E 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,5U/ml PRESENTE

ESEMPIO

1,2 1,4 1,6 1,8 2 2,2 2,4 2,6 2,8 3 3,2 3,4 3,6 3,8 4 4,2 Unità Bethesda/mL

ALGORITMO DIAGNOSTICO

aPTT della miscela Negativo (carenza) Positivo (interferenza) FVIII (1 tempo) FVIII <<< Bethesda positivo LAC test Negativo Diagnosi EAA Positivo Diagnosi EAA complicata da LAC FVIII < FVIII cromogenico normale LAC test Positivo Diagnosi LAC

DIAGNOSI LUPUS ANTICOAGULANT

Criteri per la diagnosi di LA proposti dai SSC della ISTH

  Prolungamento di un test PL dipendente ( test di screening ) Mancata correzione del prolungamento aggiungendo al plasma del paziente plasma normale ( studi di mixing ) = esclusione eventuali  plasma del paziente un eccesso di fosfolipidi ( test di conferma ) = dimostrazione che l’inibitore presente è diretto contro i PL

Brandt JT, Thromb Haemost 1995; 74: 1185-90

TESTs PER LA RICERCA DEL LA

Test di screening: PTT-LA PTT-LA mix KCT (sec.) KCT mix DRVVTest DRVVT mix Test di conferma: SCT1 ratio (bassa conc. PL) SCT2 ratio (alta conc. PL) DRVVTest confirm

DIAGNOSI DIFFERENZIALE

Test di screening PL dipendenti corregge Studi di mixing 1:1 non corregge Dosaggio fattori non corregge Test per Ab anti fattori Test di conferma con eccesso di PL corregge Diagnosi di LA

CONCLUSIONI

Dati clinici anamnestici ed attuali

Diagnosi

Dati di laboratorio La diagnosi deriva dalla corretta valutazione delle informazioni cliniche e dei dati di laboratorio ottenuti mediante la esecuzione di tests mirati.