Transcript Előadás8
Elválasztástechnikai Kutató és Oktató Laboratórium Elválasztástechnika kv1n1lv1 Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna A folyadékkromatográfiás állófázisok - szervetlen FÉMOXIDOK: SiO2, Al2O3, CaO, MgO, BaO, TiO2, CeO2, ZrO2, SÓK: SZILIKÁTOK, Mg-Al szilikátok és egyéb összetett vegyületek (Florisil, földpátok, bentonit, kaolin, síkpor, agyag) KARBONÁTOK, SZULFÁTOK (Ca-Mg-karbonát, Ca-szulfát), FOSZFÁTOK (Ca-, Zr-, HIDROXI APATIT) NITRIDEK – BN PORÓZUS ÜVEG SZEMCSÉK (Controlled Pore Glass, CPG 75-3000 μm) CPG GLYCOPHASE (gliceropropilszilán réteggel) SZERVETLEN (SZILIKA) – SZERVES (POLIMEREK) KEVERT TÍPUSOK Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna A folyadékkromatográfiás állófázisok - szerves SZÉN (aktív C, porózus grafitált karbon, PGC) POLISZACCHARIDOK (cellulóz, keményítő, porcukor) DEXTRÁN (keresztkötésekkel térhálósított gélek, Sephadex) AGARÓZ (agar-agar, agaropektin) POLIAMID POLIAKRILAMID (akrilamid - metilén bis-akrilamid kopolimer) POLIETILÉN IMINEK Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Szilika alapú állófázisok Spherical Silica Sols Xerogels Irregular Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Monolit oszlopok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Állófázisokkal szemben támasztott követelmények • Stabilitás (nyomás, hő, pH, oldékonyság, bakteriális, kémiai…) • Minél kisebb és homogénebb szemcseátmérő (hatékonyság és nyomásesés) • Energetikai homogenitás (visszatartásért felelős helyek homogén eloszlása); Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Állófázisok jellemzése Állófázisok jellemzése: Ideális eloszlás Az átlagos pórus átmérő A fajlagos felület A fajlagos pórustérfogat Pórus átmérő gyakoriság (%) Ne legyen pórusgátlás (Feltétele hogy a molekula mérete egy nagyságrenddel kisebb legyen mint pórusátmérő) Ideális eset Későn jön ki (tailing) Elválasztástechnika Beszorul (tailing) dp átlag 2011 dp (nm) Eke Zsuzsanna A szilikagél felülete Szilikagél határfelülete (pH = 2 – 8) Határfelületen nem OH OH OH OH disszociált szilanol csoportok O Si O Si Si O O Si O Szilárd fázis O O O O Szerkezetéről kevés a megbízható információ (a porózus szilikagél termodinamikailag és kinetikailag nem stabil forma - stabil forma a kristályos szerkezet „kvarc”) H Vicinális szilanol csoportok Izolált szilanol csoportok H H O Dezaktivált szilanol csoportok H H H OH OH O O O O Si Si Si Si Si Si O O O O O O Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása Legproblémásabb szennyezők: Fe(III), Al (III) Problémák: •Kelát képzés •Reaktív/savanyúbb szilanol csoportok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fémszennyezések hatása Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Távtartó Árnyékoló Kölcsönható CH3 Si O Si CH2 CH2 CH2 CN NH2 NO2 CH(OH)-CH2(OH) CH3 C18 ….. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok NORMÁL (poláris) FÁZISOK FORDÍTOTT FÁZISOK (RP) - OH (diol) - C2, -C4, -C8, -C18 - CN (ciano) - C6H5 (fenil) - NO2 (nitro) - etil, - NH2 (amino) - i-propil - N(CH3)2 (dimetil amino) - i-butil Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Módosított szilika állófázisok Classic ODS Sterically Protected (non-endcapped) Conventional Conventional (endcapped) (non-endcapped) H H H * Savasan hidrolizálhat Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) NP: Az álló fázis polárisabb, mint a mozgó fázis Mikor alkalmazzuk? Apoláris vagy kevésbé poláris vegyületek meghatározására; Hexán oldható vegyületek; Helyzeti izomerek elválasztására. Állófázisok Szilikagél (40-50%); Alumínium-oxid (3-10%); Királis állófázis (20-25%); Módosított szilikagél (pl. NH2, CN, NO2, diol stb.). Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Komponens adszorpcióját befolyásoló tényező (minél nagyobb a kötödés, annál nagyobb a visszatartás): a vegyület leszorítja az oldószer molekulákat a szilárd fázis felületéről; Oldószer víztartalma (H-hidas kötésekkel megakadályozza a vegyületek megkötődését, víztelenítés vízmentes különböző polaritású oldószerekkel vagy N2-el szárítás 150C-on; Pórusok átmérője; Szilanol csoportok típusa; Fémszennyezők jelenléte (polarizálja a szilanol csoportot), a harmadik generációs szilikagélekre a fémtartalom < ppm). Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia Aluminium-oxid (pH = 2 – 12 ) Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt (általában bázikus vegyületeknél); Gyengébb adszorpciós kölcsönhatást mutat; Olyan vegyületek vizsgálatára, amelyek savkatalízisre bomlanak; H Alakszelektivitást szeretnénk elérni; általában Szilikagéltől eltérő szelektivitás. Módosított szilikagél (pH = 2 – 8 ) Al2O3 •Ritkábban alkalmazzuk, mint a szilikagélt; •Víz dezaktiváló hatás csökkentése; Mert jobb a pórusszerkezet u (cm/sec) •Szelektivitás növelése; •A mozgófázis polaritásától függően lehetnek fordított fázisú töltetek!!! Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Mozgófázisok (eluens) Apolárisabb az állófázisnál Oldja a mintát és ne reagáljon a minta komponensekkel Detektor kompatibilitás Megfelelő tisztaságú (szilárd szennyezők, O2 mentes stb.) Alacsony viszkozitású ( < 1 cP 25C-on) Könnyen beszerezhető, elfogadható áron Biztonságos (CCl4 benzol stb. egészségre káros) Könnyen keveredő Forrpont (nem túl alacsony buborékképződés miatt) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Normál fázisú folyadékkromatográfia (NP) Alap oldószerek: Oldhatóság, polaritás növelő oldószerek: Hexán Heptán Izooktán Diklórmetán Diklóretán Kloroform (stabilizálás etanollal !!!) Modifikátorok: Módosító szerek az állófázis felületét megváltoztatják (csökkentik a retenciót); Fém szennyeződések maszkírozására ecetsavat Vizet és aminokat nem használunk – irreverzibilisen kötődnek Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia (RP) RP: az álló fázis apolárisabb mint a mozgó fázis A leggyakrabban alkalmazott folyadékkromatográfiás módszer (elválasztások 80%-a); Állófázisok Szilikagél alapú; (80-90%) (pH = 28); Szerves polimer alapú; (5-10%) (pH = 114); Egyéb (szén alapú, zeolit, alumínium-oxid alapú stb.; 2-10%) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia Szerves polimer alapú állófázisok -A teljes pH tartományban alkalmazhatóak; -Térhálós szerkezetűknek tulajdoníthatóan nagy mechanikai stabilitással rendelkeznek; -Mikropórusok képződése elkerülhetetlen, így kinetikai hatékonyságuk kisebb mint a szilikagél alapú állófázisoké. H C CH2 HC CH2 HC CH2 H C CH2 + C CH2 H C C H H2 Sztirol Divinil-benzol Elválasztástechnika Kopolimer 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia Szerves polimer alapú állófázisok -A szerves polimert oldó oldószerek (klórozottak) duzzasztják a polimert, ettől összeroppan -Apoláris jelleg csökkentésére módosítják a polimert (pl. szulfonil, piridin stb.) H C CH2 H C C H2 H H C CH2 C N SO3H Polaritást növelő módosítások Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Eluenserősség Elúciós erő Víz< Metanol<Acetonitril<Etanol<Izopropanol<Tetrahidrofurán Szelektivitás Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Az eluensek legfőbb tulajdonságai Tisztaság Viszkozitás Refraktív index Forráspont Toxicitás UV-Cutoff Oldhatóság/elegyíthetőség/oldóképesség Elválasztástechnika 2011 26 Eke Zsuzsanna Solvent Miscibility Name Acetic Acid Acetone Acetonitrile Benzene Butyl Alcohol Carbon Tetrachloride Chloroform Cyclohexane Cyclopentane Dichloroethane Dichloromethane Dimethylformamide Dimethyl Sulfoxide Dioxan Ethylacetate Ethyl Alcohol Di-Ethylether Heptane Hexane Methyl Alcohol Methylethyl Ketone I-Octane Pentane I-Propyl Alcohol Di-Propylether Tetrachloroethane Tetrahydrofuran Toluene Trichloroethane Water Xylene Elválasztástechnika Immiscible Miscible 2-Propanol is an excellent intermediate solvent 2011 27 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú kromatográfia - mozgófázisok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Semleges A pH nem befolyásolja a molekula állapotát, ezért NINCS szükség a pH ellenőrzésére. Semleges vegyületek: •Polikondenzált aromások; •Halogénezett aromás vegyületek; •Alkoholok; •Éterek; •Ketonok; •Aldehidek •Stb. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Savas jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-COOH R-COO- Nemionizált forma (apolárisabb) R COOH Ka 105 pKa 5 H+ Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) R COO H Ka + LeChatelier elv HA pH pKa 5 ; 50% ionizált HA pH 4 ; 10% ionizált HA HA pH 3 ; 1% ionizált pH 6 ; 90% ionizált Sosem kromatografálunk pH = pKa értéken !!! Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pKa pKa+2 Robusztus !!! pH=2 pKa-2 Robusztus !!! K’ k !!! pH=8 pH Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Bázikus jellegű funkciós csoportot tartalmazó vegyületek A pH befolyásolja a molekula állapotát, ezért fontos a pH ellenőrzése. R-NH2 + H+ R-NH3+ Nemionizált forma (apolárisabb) Ionizált forma (polárisabb-vízoldható) k pKb pKb+2 Robusztus !!! K’ Robusztus !!! pH=2 pKb-2 !!! pH=8 pH Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben pH kontroll pufferek segítségével történik (csak szükség esetén használjuk, mert csökkentik az állófázis élettartamát!) Puffer koncentrációja (2mM-0,2M tartományban) Gyakran használt pufferek: Foszfát Citrát Trisz(hidroximetil)-aminometán Acetát Formiát Stb. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Fordított fázisú folyadékkromatográfia A pH szerepe az RP-HPLC-ben Pufferekkel szemben támasztott követelmények: A puffer UV cut-off-ja kisebb mint a detektálási hullámhossz; Szilárd szennyező mentes (szűrni kell !!!); Adott pH-án mikroorganizmusok (alga, baktérium) képződése; Puffer kompatibilitás a szerves oldószerekkel (kicsapódik magas szerves oldószertartalomnál-szerves pufferek oldékonysága nagyobb); A minta stabilitása nagy legyen az adott pufferben; Puffer mentesítés (vízzel kezdjük majd szerves oldószerrel); Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Praktikus tanácsok a HPLC-s oszlopokkal kapcsolatban Avoid any physical stress to the column Close on both ends to avoid dryness Store the column well flushed with the appropriate solvent Record the history of the column Elválasztástechnika 2011 35 Eke Zsuzsanna Column Installation Each column has a defined flow direction! The flow direction is shown by the arrow or direction of writing. Don’t change the flow direction, this will decrease column performance. Elválasztástechnika 2011 36 Eke Zsuzsanna Column Care and Handling Wash the column after use with selected solvents; flush highly retained sample components from the column. Do not store a column in 100% water. Microbes may grow and clog the column. Don’t open the column and repack the material if you want to maintain performance. Use the column at its optimal flow rate - avoid high flow rates. Do not operate silica or bonded phases for extended periods at high temperature. Keep the pH of the mobile phase in an appropriate range for the column. Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Detektorok Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna A detektorok legfőbb jellemzői Szelektív – univerzális Dinamikus tartomány Linearitási tartomány Érzékenység Destruktív – nem destruktív Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna A folyadékkromatográfiás detektorok Komponensek tulajdonságát észlelik UV- látható abszorbancia detektor (UV- VIS) Fluoreszcenciás detektor (FLD) Elektrokémiai detektor (ECD) Radiokémiai detektor (RD) Tömeg detektorok (MSD) Előnyök: specifikusság, érzékenység, szelektivitás Hátrányok: minden vegyület más (pl. más UVmax) Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna A folyadékkromatográfiás detektorok Mozgófázis tulajdonságát észlelik Törésmutató detektor (RID) Vezetőképesség detektor (CD) Fényszórásos detektor (LSD) Előnyök : nagyon sok komponensre – majdnem univerzális Hátrányok: zaj, érzékenység Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor Alapelv: Lambert-Beer törvény I A log10 l c I0 Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor Chromophore Structure max(nm) Amine - NH2 195 Ethylene -C=C- 190 C=O 195 Ester - COOR 205 Aldehyde - CHO 210 Carboxyl - COOH 200-210 Nitro - NO2 310 Ketone Phenyl 202, 255 Naphthyl 220, 275 Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV spektrum Abszorbancia Benzamidofenol (mAU) Paracetamol Kromatográfiás elválasztás; Minél magas hullámhossz annál 280 nm szelektívebb 4 3 max pH függése 2 oldószerek, adalékok UV elnyelése 1 0 200 250 300 350 Hullámhossz (nm) Elválasztástechnika 400 2011 Eke Zsuzsanna UV-VIS detektor – UV Cutoff Solvent UV Cutoff (nm) Acetonitrile Water Cyclohexane 190 190 195 Hexane Methanol Ethanol Diethyl Ether 200 210 210 220 absorbance equals 1, Dichloromethane 220 reference. Chloroform Carbon Tet 240 265 Tetrahydrofuran 280 (220) Toluene 285 Elválasztástechnika UV cutoff is the wavelength at which measured in a 1 cm cell with air as a 2011 Eke Zsuzsanna VWD – Variable Wavelenght detector Diffrakciós rács lencse tükör tükör deutérium lámpa tükör Fénynyaláb A diffrakciós rács monokromatikus osztó fényt állít elő Átfolyó cella Minta fotodióda tükör A monokromatikus fényt megosztjuk a referencia és minta fotodióda között Az intenzitásbeli különbséget a cellában történő abszorbancia okozza Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Diódasoros detektor – DAD, Diodarray detector Vis Lamp Achromatic Lens Diode Array Detector Flow Cell UV Lamp Homium Filter Optical Slit Elválasztástechnika 2011 Grating Eke Zsuzsanna Deutérium lámpa tesztje Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna On-line spektrum Spectra Absorbance Wavelength Time Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna Csúcstisztaság Peak with time marker for spectra selection Spectral differences at different points of peak elution Elválasztástechnika 2011 Eke Zsuzsanna