Transcript conceptos y aplicaciones básicas en microscopía de epifluorescencia

Introducción a la Microscopía de
Fluorescencia
Renzo Gavilanez
Motic Instruments, Inc
Microscopía de Fluorescencia
Contenido:
• Principio
• Aplicaciones
– Para Ciencias de la Vida
– Para Ciencias de Materiales
• Equipo necesario
– Microscopio
•
•
•
•
Fuentes de Luz
Juego de Filtros
Selección de filtros
Lentes Objetivos
Fluorescencia
Espectro de luz visible:
La longitud de onda determina el color
Fluorescencia
¿Qué es?
Es un proceso de interacción entre la radiación y la materia
en el cual un material absorbe radiación de una fuente
específica y muy rápidamente emite luz cuya energía es
menor (de mayor longitud de onda) que la de la radiación
que ha absorbido.
Fluorescencia
Espectro de luz visible:
Excitación
Emisión
Fluorescencia
¿Cómo se produce?
Los electrones son excitados a estados
vibracionales y rotacionales más altos y cuando
vuelven a su estado fundamental emiten la energía
de excitación en forma de radiación.
Fluorescencia (definiciones)
● Debido a la disipación interna de energía la luz
emitida tiene siempre una longitud de onda mayor
(menor energía) que la luz de excitación.
● La cantidad de luz emitida es muy pequeña en
comparación con la utilizada para la excitación.
● Los materiales que fluorescen lo hacen porque
contienen estructuras con configuraciones
moleculares particulares conocidas como fluoróforos
o fluorocromos.
Fluorescencia (definiciones)
● Un fluorocromo es una molécula capaz de absorber
fotones y emitir fotones de menor energía (mayor
longitud de onda).
● Un fluoróforo es la parte del fluorocromo
responsable de la emisión de la fluorescencia.
Fluorescencia (definiciones)
Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia primaria es la que se da porque
existe una configuración inherente a la estructura
molecular.
Algunas de las fluorescencias más intensas que se
observan se asocian con moléculas aromáticas, la
fluorescencia de materiales inorgánicos se observa
en muchos minerales y piedras preciosas, y quelatos
específicos:
Clorofila, aceite de inmersión, GFP
Fluorescencia (definiciones)
Tipos de fluorescencia:
● La fluorescencia secundaria ocurre cuando una
molécula específica o un grupo capaz de fluorescer,
un fluorocromo, se introduce en la estructura de la
muestra.
Éste es el procedimiento para la mayoría de las
aplicaciones biológicas de la microscopía de
fluorescencia.
Fluorescencia
Espectros de excitación y emisión:
Debido a la diferente configuración electrónica de los
fluorocromos cada uno presenta un espectro de
excitación y de emisión característico y único.
Los fabricantes dan el pico de máxima excitación y
el pico de máxima emisión o bien los espectros de
excitación y emisión.
Fluorescencia
Espectros de excitación y emisión: Fluoresceína (FITC)
pH = 9
pH = 13
Fluorescencia
¿Porqué usar Fluorescencia?
 Para facilitar pequeñas estructuras debido al alto
contraste de la imagen sobre el fondo (buena
relación señal a ruido)
 Fondo Negro (pupilas se abren apliamente)
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
Ciencias de la Vida
1.
Inmunohistoquímica/Histología
Para identificar la distribución de una proteína
específica dentro de un tejido, un fluorocromo puede
ser usado para marcar la proteína vía un anticuerpo
2. Biología
•
Para monitorear rápidamente concentraciones
fisiológicas cambiantes de iones, e.g. calcio,
magnesio y valores pH en células vivas.
•
Para estudiar viabilidad de tejidos
animales/humanos y patógenos.
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
EGFP expression in muscles of C. elegans
Filtersystem: EGFP longpass
GFPs como proteína que se expresa en cuerpos vivos
(GFP: Proteína fluorescente verde, de medusa Aequorea)
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
Dapi
FITC
Cy 3
Cy 3.5
Cy 5
Cy 7
Cromosomas con 6 fluorocromos
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
FISH (Fluorescence in situ Hybridisation)
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
II. Ciencia de Materiales
• Inspección de Circuitos electrónicos
• Investigación de contaminantes en wafers
semiconductores
• Estudios de sedimentación petrológica en rocas
Microscopía de Fluorescencia - Aplicaciones
Huecos en concreto
Equipo Necesario
Que equipo se requiere?
 Microscopio con accesorio de fluorescencia
 Fuente de luz: HBO 50/100 Watt o LED
 Set de Filtros (3 filtros en 1 cubo)
 Objetivos con alta apertura numérica (A.N.)
Equipo Necesario
Equipo Necesario
•Fuente de poder
•Accesorio de fluorescencia
•Caja de lámpara
•Cubos con filtros
Equipo Necesario
Equipo Necesario
Equipo Necesario
La lámpara de mercurio
Lámpara de mercurio HBO100Watt
Arco de dimensión pequeña
Gran cantidad de energía
Relación Excitación/Emisión
10000:1
Conclusión: Utiliza cada fotón disponible
Equipo Necesario
Las lámparas LED o de Aluro Metálico
 Lámpara LED específica para cada longitud de
onda, larga vida, no requiere reemplazo de
lámpara, no caliente, no se requiere centrado,
permite controlar intensidad
 Lámpara Aluro Metálico genérica para todas las
longitudes de onda, larga vida, no requiere
reemplazo de lámpara, no caliente, no se
requiere centrado, permite controlar intensidad
Equipo Necesario
El cubo con filtros
 Filtro de Excitación
 Espejo dicróico
 Filtro de Barrera o
Emisión
(longpass, bandpass)
Filtros Estándard de Fluorescencia
• DAPI & Hoechst:
Exciter D350/50
Dichroic 400LP
Emitter D460/50
• FITC:
Exciter D480/30
Dichroic 505LP
Emitter D535/40
• TRITC/Cy3:
Exciter D540/25X
Dichroic 565DCLP
Emitter D605/55m
Especificacón del Filtro
- FITC Perfiles de Absorción y Emisión
100
%T
abs 50
em
[rel]
exciter
dichroic
longpass emitter
absorption FITC
emission FITC
0
300
400
500
wavelength [nm]
600
700
Selectividad de Filtros
DAPI
Selectividad de Filtros
FITC
Selectividad de Filtros
TRITC
Selectividad de Filtros
Sobreposición
de imágenes
Selectividad de Filtros
DAPI
Selectividad de Filtros
FITC
Selectividad de Filtros
TRITC
Selectividad de Filtros
Sobreposicionamiento
MultiFocus!
Sistemas de Filtros de banda Dual/Triple
CFP / YFP / DsRed
CFP / YFP / DsRed tripleband
100
Exciter
Polychroic
Emitter
%T
50
Hela cell, tripleband
CFP / YFP / DsRed
0
300
400
500
600
wavelength [nm]
700
800
+ Visión completa
+ no requiere cambio de filtro (tiempo
real)
+ desplazamiento de píxel cero
± colores mezclados
Hela cell, singleband
overlay (mFIP, SIS)
- Pérdida de intensidad comparada con
filtros de una sola banda
Equipo Necesario
Lentes Objetivos
 No existe conexión directa entre
lentes de fluorita y fluorescencia
 Fluorita viene de CaF2, un mineral
usado antiguamente para fabricar
objetivos de gran apertura
numérica
 La Apertura Numérica es más
importante que la corrección de
curvatura
 Se pueden usar objetivos de
contraste de fases pero no es
recomendable porque reducen
entre un 15 - 20% de intensidad
Plan
Apo
20x/0.60
Plan
Fluar
20x/0.50
Plan
20x/0.
40
FIN
Gracias por prestar
atención!!!