Transcript Exercice 1
Enseignements dirigés Biochimie PCEM 1 Acides Aminés – Oligopeptides Méthodes d’étude
L. Coulbault
Année 2008-2009
I – Equilibre acide-base
Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.
B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante.
C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).
D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage.
E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration.
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES HA A- + H+ Ka = constante de dissociation Ka = [H+].[A-] ________ [AH] Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
+ B + A A = point d'équivalence où le pH varie beaucoup B = Point de demi-neutralisation = pKa où le pH varie peu Donc [A-] = [AH]
SOLUTIONS TAMPONS * Un tampon est généralement constitué d’une solution d’acide faible et d’un de ses sels de base forte ou d’une solution de base faible et d’un de ses sels d’acide fort pH = pKa + log 10 [Sel]/[AH] * Autour de son pKa , [A-] = [AH] et le tampon maintient le pH d'une solution Résistant aux modifications de pH quand ajout de H+ ou OH-
Exercice 1
Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.
FAUX B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante VRAI C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).
FAUX
Exercice 1
D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage VRAI E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration FAUX
A/ B/ C/ D/ E/ F/
Exercice 2
Parmi les produits suivants, quel(s) est (sont) celui (ceux) qui peut (pourront) en théorie être utilisé(s) pour le dosage de l’activité d’un enzyme dont le pH optimum d’activité est de 7,5 ?
Tris hydroxyméthyl aminométhane Acide propionique Pipéridine Acide phosphorique Hydroxyde d’ammonium Acide acétique pKa=8.06
pKa=4.87
pKa=11.2
pKa1 = 2.15, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.33
pKa=9.25
pKa=4.76
pH = 7,5 pKa de la molécule doit être proche de la valeur de pH voulue donc Acide phosphorique à son pKa2 = 7,2 éventuellement Tris (8,06)
Propriétés Structurales des Acides Aminés
Définition d’un acide aminé H
* *
NH 2 / NH 3 +
- C* -
COO
-
/COOH
R
Chaine latérale variable 20 AA impliqués dans la structure des protéines
AA ALIPHATIQUES NEUTRES Aliphatique :
R = chaîne latérale hydrocarbonée linéaire ou ramifiée
Neutre :
Ne possède pas de fonction carboxylique (COOH) ou aminée (NH 2 ) supplémentaire sur R
* A CHAINE HYDROCARBONEE.
Glycine ou Gly R = H seul AA sans C asymétrique donc dépourvu de pouvoir rotatoire Alanine ou Ala R = - CH 3 Valine ou Val CH 3 R = - CH- CH 3 Leucine CH 3 ou Leu R = - CH 2 - CH - CH 3 Isoleucine ou Ile R = - CH – CH 2 - CH 3 CH 3
* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser R = - CH 2 -OH fonction alcool primaire Thréonine ou Thr R = -CHOH-CH 3 fonction alcool IIre * A FONCTION SOUFREE -SH.
Cystéine ou Cys Méthionine ou Met R = - CH 2 – SH (SH = gpt thiol) R = - CH 2 - CH 2 - S- CH 3
AA AROMATIQUES NEUTRES (possèdent une structure cyclique de type benzénique) Responsables de l’absorption dans l’UV des protéines Phénylalanine ou Phé Tyrosine ou Tyr qui possède une fonction phénolique Tryptophane ou Trp Absorbe à 280 nm
Proline ou Pro AA NEUTRE HETEROCYCLIQUE
AA ACIDES (possédent un groupement acide carboxylique supplémentaire sur la chaîne latérale) NB :leurs dérivés : la glutamine (Gln) , l’asparagine (Asn) sont considérés comme des AA neutres
AA BASIQUES (possédant une fonction aminée supplémentaire sur la chaîne latérale)
STEREOCHIMIE perspective COO NH 3 + C R série L H H COO C NH 3 + R série D
Notion de polarité
Ex de l’eau : Atome O très électronégatif (attraction des électrons ++) Formation d’un dipôle permanent + Favorise la formation des liaisons hydrogène.
Fonction acide carboxylique/Gpt phosphate/Gpt Ammonium + Hydroxyles
AA avec Groupement polaire: Polaires non ionisables : Ser(OH),Thr (OH), Asn, Gln Polaires ionisables en fonction du pH : Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr seuls les AA ionisables (Lys , Arg, His, Asp, Glu) peuvent intervenir dans une liaison ionique à pH physiologique (car groupements NH3+ ou COO-) NB : Pour Tyr (O /OH) et la Cys (S /SH) au pH physiologique, pas de dissociation de Tyr (OH) et Cys (SH) au regard de leur pKa (groupement chargé seulement à pH basique)
Le caractère polaire ou apolaire d’une molécule dépendra de la présence ou non d’une ou plusieurs fonctions chimiques supplémentaires.
M Phe Leu Ile Val Ala Gly Met Cys Trp Tyr Thr Pro Ser His Glu Gln Asp Asn Lys Arg Polarité Hydrosolubilité est fonction de la proportion de groupements polaires dans la molécule.
Exercice 3
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun : A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale C/ Une chaîne latérale chargée D/ Une chaîne latérale apolaire E/ Elles n’ont aucun point commun
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun : A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale FAUX B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale VRAI C/ Une chaîne latérale chargée FAUX D/ Une chaîne latérale apolaire VRAI E/ Elles n’ont aucun point commun FAUX
Exercice 4
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : La sérine et la thréonine sont : A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de nature phénolique B/ de la série D à l’état naturel C/ des acides aminés basiques D/ des acides aminés alcool E/ des acides dicarboxyliques.
Exercice 4
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : La sérine et la thréonine sont : A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de nature phénolique FAUX B/ de la série D à l’état naturel Série L (série D ex : glucose) C/ des acides aminés basiques FAUX
* A FONCTION ALCOOL –OH.
Sérine ou Ser R = - CH 2 -OH fonction alcool primaire Thréonine ou Thr R = -CHOH-CH 3 fonction alcool IIre D/ des acides aminés alcool VRAI E/ des acides dicarboxyliques.
FAUX
:
Exercice 5
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont A. La phénylalanine.
B.
L’arginine.
C.
D. L’acide aspartique.
E.
La glutamine.
La glycine.
Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont des AA présentant une chaîne latérale ionisable AA acides AA basiques Polaires ionisables en fonction du pH : Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr
Exercice 5
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont : A.
La phénylalanine B.
FAUX L’arginine C.
VRAI La glutamine FAUX
D.
L’acide aspartique VRAI E. La glycine.
FAUX
Exercice 6
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Parmi les acides aminés suivants, les acides aminés essentiels sont : A/ La leucine B/ Le tryptophane C/ La glycine D/ L’alanine E/ La lysine
AA essentiels : Pas de synthèse par l’organisme Val / Leu / Ile / Lys / Phe / Trp / Met / Thr / His / Arg Arg et His sont synthétisés par les tissus, mais en quantité insuffisante pour le soutien de la croissance chez les enfants Réponses A, B, E
Exercice 7
Certains neurotransmetteurs proviennent de la transformation biochimique d’un acide aminé ; le(s)quel(s) ?
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Acétylcholine B/ Noradrénaline C/ Sérotonine D/ Dopamine E/ Acide -amino butyrique (GABA)
Ex : Dopamine Sérotonine Histamine
A/ Acétylcholine FAUX B/ Noradrénaline VRAI (tyrosine DOPA Dopamine NorAd Ad) C/ Sérotonine VRAI (tryptophane) D/ Dopamine VRAI (tyrosine) E/ Acide -amino butyrique (GABA) VRAI (précurseur : glutamate)
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes : A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5 B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25 C. Le pHi calculé pour X est de 10,75 D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé
Propriétés acido-basiques des acides aminés
EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES HA A- + H+ Ka = constante de dissociation Ka = [H+].[A-] ________ [AH] Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])
SIGNIFICATION DES pKA DES AA (Valable pour tous les AA) Gpt (COO /COOH) pKa1 (# 2-2,5) pKa1 = pH pour lequel [ a COO ] = [ a COOH] Gpt (NH 2 /NH 3 + ) pKa2 (# 9-10) pKa2 = pH pour lequel [ a NH 2 ] = [ a NH 3 +] POINT ISOELECTRIQUE (pI ou pHi) pH pour lequel le nombre de charges positives est égal au nombre de charges négatives
O-
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE Cas de l’Alanine à pH << pKa1 (donc < 2) = pH acide Les 2 Gpts sont sous forme protonée a COOH et a NH 3 + COOH-CHR-NH 3 + charge nette = +1 cation à pH = pKa1 [ a COO ] = [ a COOH] et forme majoritaire a NH 3 + (pH < pKa2) charge nette : Pour 2 molécules, CN= (2 charges (+) + 1 charge (-))/2= +0,5
O O-
A pH compris entre pKa1 et pKa2 forme majoritaire [ a COO ] (pH > pKa1) forme majoritaire a NH 3 + (pH < pKa2) Forme majoritaire de l’AA = zwitterion COO - CHR – NH 3 + charge nette = 0 pI = pH pour lequel la molécule est électriquement neutre pI = (pKa1 + pKa2)/2
O-
O-
à pH = pKa2 [ a NH 2 ] = [ a NH 3 +] et forme majoritaire a COO (pH >>> pKa1) charge nette = ((1 x +1)+ (2x-1))/2 = -0,5 (en moyenne) à pH >> pKa2 (donc > 10) donc pH basique gpts sous forme déprotonée COO et NH 2 COO – CHR – NH 2 charge nette = -1 anion
O-
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE Cas de l’acide glutamique Une fonction acide carboxylique supplémentaire NH 2 - CH – CH 2 - CH 2 COOH COOH Caractérisé par 3 pKa : pKa1 = pH pour lequel [ a COO ] = [ a COOH] - pKa2 = pH pour lequel [ a NH 2 ] = [ a NH 3 +] - pKa3 = pH pour lequel [ CL COO ] = [ CL COOH]
pH << pKa1 Tous les gpts sous forme protonée : a COOH, CL COOH et a NH 3 + charge nette : +1 pH compris entre pKa1 et pKa3 Gpts sous forme a COO , CL COOH et a NH 3 + charge nette :0 (zwitterion) pI = (pKa1+ pKa3)/2 = 3,25
pH compris entre pKa3 et pKa2 Gpts sous forme a COO , CL COO et a NH 3 + charge nette : -1 pH >> pKa2 Gpts sous forme a COO , CL COO et a NH 2 charge nette : -2
INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTE Cas des acides aminés basiques Ex : Lys ; une fonction amine supplémentaire NH 2 - CH – CH 2 - CH 2 – NH 2 COOH Présence de 3 pKa pKa1 = pH pour lequel [ a COO ] = [ a COOH] - pKa2 = pH pour lequel [ a NH 2 ] = [ a NH 3 +] -pKa3 = pH pour lequel [ CL NH 2 ] = [ CL NH 3 +]
pI = (pKa2 + pKa3)/ 2
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes : A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5 B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25 C. Le pHi calculé pour X est de 10,75 D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé
Exercice 8
Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5.
Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes : A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5 Zwitterion majoritaire si pH proche du pHi Valeur pKa3 élevée d’où acide aminé basique Calcul du pHi pHi = ( 9 + 12,5) / 2 = 10,75
B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25 Faux C. Le pHi calculé pour X est de 10,75 cation Vrai D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de Faux pH << pHi , charge nette + pH # pHi, charge nette nulle pH >> pHi, charge nette E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé Faux
Exercice 9
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Les techniques permettant la séparation des acides aminés en solution sont : A/ L’électrophorèse B/ L’ultracentrifugation C/ La chromatographie liquide D/ L’électrophorèse capillaire E/ La chromatographie d’échange d’ions
ELECTROPHORESE Principe
Une molécule chargée se déplace dans un champ électrique vers l’électrode de signe opposé à sa charge.
Gel d’agarose Gel d’acétate de cellulose
Cathode Anode
: électrode chargée négativement : électrode chargée positivement
ELECTROPHORESE CAPILLAIRE :
(=séquenceur) principe identique, Séparation d’un mélange complexe dans un capillaire soumis à une différence de potentiel élevée ; Pouvoir de séparation très important.
Utilisé par exemple pour la détermination de séquences nucléotidiques
La vitesse de migration d’un AA dans un champ électrique est fonction de la
charge globale de l’AA
donc - fonction du
pH de la solution d’électrophorèse A retenir
pH << pHi , charge nette + = cation migrant vers la cathode pH # pHi, charge nette nulle = zwitterion ne migrant pas pH >> pHi, charge nette - = anion migrant vers l’anode
ULTRACENTRIFUGATION DE ZONE.
M. (1-v.r) S= ____________ f Avec M : masse moléculaire S : coefficient de sédimentation V : volume spécifique partiel de la particule R : densité de la solution F : coefficient de friction.
METHODES CHROMATOGRAPHIQUES : Chromatographie en couche mince
METHODES CHROMATOGRAPHIQUES : Chromatographie liquide (CLHP)
Solvants Echantillons Pompe Injecteur Colonne Détecteur Séparation Ex : - C18 - Echange d’ions Ex : -UV-visible - Fluorimétrie
CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS Colonne : résine synthétique munie de groupements chargés résine échangeuse de cations : charges – Ex résine de polystyrène sulfoné (ions SO 3 ) carboxyméthylcellulose : C0 2 - CH 2 – O – cellulose résine échangeuse d’anions : charges + DEAE-cellulose : (CH 3 -CH 2 ) 2 NH + - (CH 2 ) 2 - cellulose
Technique reposant sur l’interaction électrostatique entre un AA chargé et une particule stationnaire portant une charge de signe opposé.
L’interaction peut-être modifiée en faisant varier le pH, donc en variant les charges des AA et donc leur vitesse de migration le long de la colonne
Résine portant des charges - (échangeuses de cations)
À pH 2, tous les AA sous forme de cations = fixation de tous les AA sur la colonne Si on augmente le pH, les 1ers AA à se retrouver sous forme de zwitterion sont les AA à pHi bas (AA acides) qui se détachent de la colonne et sont élués les 1ers en bas de la colonne
Exercice 9
Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Les techniques permettant la séparation des acides aminés en solution sont : A/ L’électrophorèse VRAI B/ L’ultracentrifugation FAUX C/ La chromatographie liquide VRAI D/ L’électrophorèse capillaire VRAI E/ La chromatographie d’échange d’ions VRAI
Exercice 10
On dispose d’un mélange de 4 acides aminés appartenant à la liste suivante : Glu, His, Val, Arg. Valeurs des différents pK Glu pKa1=2,2 pKa2=9,9 pKa3=4,4 Ala Arg Asp pKa1=2,3 pKa1=2,2 pKa1=2 pKa2=9,7 pKa2=9,4 pKa2=10 pKa3=12,5 pKa3=3,9 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7.
D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé.
E/ Aucune réponse bonne.
Glutamate Alanine Arginine Aspartate pKa1=2,2 pKa1=2,3 pKa1=2,2 pKa1=2 1ère étape : calcul du pHi Glutamate Alanine Arginine Aspartate pHi =3,3 pHi = 6 pHi = 10,95 pHi = 2,95 pKa2=9,9 pKa2=9,7 pKa2=9,4 pKa2=10 pKa3=4,4 pKa3=12,5 pKa3=3,9
Glutamate Alanine Arginine Aspartate pHi =3,3 pHi = 6 pHi = 10,95 pHi = 2,95 pH = 7 pH >>> pHi pH >> pHi + 2 Charge nette -- pH = 3 pH ~ pHi Zwitterion +++ pH =~pHi Charge nette pH <<< pHi - 2 Charge nette +++ pH<< Glutamate Alanine Arginine Aspartate pHi =3,3 pHi = 6 pHi = 10,95 pHi = 2,95 pH = 7 pH >>> pHi pH >> pHi + 2 Charge nette -- pH = 3 pH ~ pHi Zwitterion +++ pH =~pHi Charge nette pH <<< pHi - 2 Charge nette +++ pH<< Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés Faux B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés Faux C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7. Faux D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé. Vrai E/ Aucune réponse bonne. Faux Exercice 11 Un mélange de quatre acides aminés (Leu, His, Thr, Lys) est séparé par la technique de Finger Print (électrophorèse sur papier à pH 6 suivie d’une chromatographie ascendante en solvant organique). Après coloration à la ninhydrine, on obtient la cartographie suivante : + Electrophorèse - 4 x 2 Dépôt 3 1 On donne : Leu His Ala Lys pKa1 = 2,3 pKa1 = 1,7 pKa1 = 2,3 pKa1 = 2,0 pKa2= 9,7 pKa2= 9,1 pKa2= 9,9 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0 pKa3= 10,7 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique. B/ C/ valeur de pHi supérieure à 6. D/ chaîne latérale ionisée. E/ l’alanine. Le spot 2 correspond à l’histidine. Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à Leu His Ala Lys pKa1 = 2,3 pKa1 = 1,7 pKa1 = 2,3 pKa1 = 2,0 pKa2= 9,7 pKa2= 9,1 pKa2= 9,9 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0 pKa3= 10,7 pHi= 6 pHi = 7,05 pHi = 6,1 pHi = 9,9 Electrophorèse sur papier à pH = 6 Leu et Ala ne migrent pas His et Lys chargés positivement avec la charge la plus importante pour Lys (d’où migre le plus loin) Chromatographie avec une phase organique Les solutés migrent avec un solvant organique Les acides aminés avec une chaîne latérale très apolaire migreront en même temps que le front de solvant de la phase organique (donc migrent plus loin par comparaison aux composés les plus polaires) + Electrophorèse 4 Leu x 2 Ala 3 His 1 Lys Dépôt - Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique Faux B/ Le spot 2 correspond à l’histidine Faux C/ Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une valeur de pHi supérieure à 6 Vrai D/ Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une chaîne latérale ionisée Faux E/ l’alanine. Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à Faux La chromatographie sur résine échangeuse de cations : 1 – indique que la colonne porte des charges négatives 2 – indique que la colonne porte des charges positives 3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au temps 4 – permet la séparation de la valine et de la lysine 5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13 6 – ne peut échanger que des cations 1 – indique que la colonne porte des charges négatives VRAI 2 – indique que la colonne porte des charges positives temps FAUX 3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au FAUX 4 – permet la séparation de la valine et de la lysine VRAI 5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13 FAUX 6 – ne peut échanger que des cations VRAI Réponse D : 1,4,6 Soit un mélange de 3 oligopeptides 1/ Phe-Gly-Leu-Lys 2/ Val-Ile-Thr-Asp 3/ Ala–Gly-Trp-Ser Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélange B/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathode D/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique E/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange Phe-Gly-Leu-Lys Val-Ile-Thr-Asp Ala–Gly-Trp-Ser 1 +2 +1 +1 Valeur du pH 6 +1 -1 0 13 -1 -2 -1 Exemple à pH=6 : +H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1 A Phe-Gly-Leu-Lys B Val-Ile-Thr-Asp C Ala–Gly-Trp-Ser 1 +2 +1 +1 Valeur du pH 6 +1 -1 0 13 -1 -2 -1 Exemple à pH=6 : +H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1 A Cathode (-) B C dépôt Anode (+) A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélange VRAI B/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse FAUX C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathode FAUX D/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique VRAI E/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange FAUX Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : Voici cinq peptides : A/ Ala-Asp-Arg-Asp-Gly B/ Arg-Ala-Arg-Ala-Phe C/ Asp-Lys-Asp-Ala-Lys D/ Glu-Lys-Trp-Lys-Val E/ Glu-Asp-Ala-Asp-Val et quatre critères 1) Hydrolyse/HCl = 3 spots 2) Hydrolyse trypsique = 3 spots 3) Electrophorèse à pH 6 = migration vers la cathode 4) Absorption UV à 280 nm Lequel (ou lesquels) de ces peptides répond(ent) à tous ces critères ? Hydrolyse par HCl = séparation des AA avec destruction du Trp Ala-Asp-Arg-Asp-Gly 4 spots = Ala, Asp, Arg et Gly Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 3 spots : Arg, Ala et Phe Asp-Lys-Asp-Ala-Lys Glu-Lys-Trp-Lys-Val Glu-Asp-Ala-Asp-Val 3 spots : Asp, Lys, Ala 3 spots : Glu, Lys et Val 4 spots : Glu, Asp, Ala et Val Hydrolyse trypsique = 3 spots Trypsine = coupe la liaison peptidique du coté carboxylique des AA basiques Lys et Arg Arg Ala-Arg et Ala-Phe 3 spots Asp-Lys Glu-Lys et Asp-Ala-Lys 2 spots Trp-Lys et Val 3 spots Électrophorèse à pH 6 ; migration vers la cathode donc sous forme de cation chargé positivement Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 2 AA basiques et 3 AA neutres 3 NH 3 + et 1 COO - charge nette = +2 vrai Glu-Lys-Trp-Lys-Val 1 AA acide, 2 AA basiques et 2 AA neutres 3 NH 3 + et 2 COO - charge nette = +1 vrai Absorption dans l’UV à 280nm : oligopeptide d) Hydrolyse acide (Hcl) Séparation des AA avec destruction du Trp Trypsine : Chymotrypsine : Endopeptidase coupant l’AA basique Lys ou Arg à son extrémité carboxylique Endopeptidase coupant essentiellement les AA aromatiques du côté carboxylique Carboxypeptidase B : Exopeptidase permettant de séparer l’AA du côté carboxylique Bromure de cyanogène : Coupe du côté carboxylique de la Met. = Coupure des liaisons peptidiques b -mercaptoéthanol : rupture des ponts disulfures établis entre 2 Cys Urée 8M ioniques / Dodécylsulfate de sodium : rupture des liaisons hydrogène, Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents. L’action du b -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C. L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B. L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp. L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide. Le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire. L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obtention de deux tripeptides. Indiquer la séquence des peptides A, B et C. Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents. Attention à la terminologie : A possède huit AA et il n’est pas spécifié qu’il s’agit d’un octapeptide c-à-d enchainement de 8 AA Hydrolyse : 6 AA Possibilité de Trp (1 ou 2) détruit lors de l’hydrolyse acide ou de la présence d’un ou deux AA identiques L’action du b -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C. Mercaptoéthanol : rupture d’un pont disulfure entre 2 Cys Donc 2 Cys l’un sur l’hexapeptide B (a-b-c-d-e-f) l’autre sur le dipeptide C (g-h) B et C étants reliés par un pont disulfure pour former A L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B. Carboxypeptidase B : exopeptidase permettant de séparer l’AA du côté carboxylique Donc f = Ile h = Arg et g = Cys Donc B = a-b-c-d-e-Ile (dont 1 cys) et C = Cys-Arg L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH Asp Réactif d’Edman : Réaction qui permet de séquencer l’oligopeptide à partir de son extrémité aminée Donc a = Asp L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide. Deux info : Tétrapeptide contient 1 Trp détruit par l’hydrolyse acide Donc 8 AA : Cys (2), Trp, Asp, Ile, Arg, Lys, X Par hydrolyse acide, 6 spots correspondant à 6 AA différents Cys, Asp, Ile, Arg, Lys et X B = tétrapetide-dipeptide ou dipeptide-tétrapeptide Or le tétrapeptide contient Asp = a-b-c-d = Tétrapeptide = Asp – (Trp,X)- Lys Donc B = Asp – (Trp, Gly) – Lys – Cys – Ile Car le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire. Il s’agit de Gly. L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obten tion de deux tripeptides. Donc c = Trp et b = Gly pour obtenir deux tripeptides Asp-Gly-Trp et Lys-Cys-Ile C = Cys-Arg B = Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile A Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile S S Cys -ArgExercice 12
Exercice 13
Exercice 14
Exercice 15