Aminoácidos, peptídeos e proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Características químicas dos aminoácidos

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Os aminoácidos

• • Os aminoácidos presentes nas proteínas são

isômeros L

– A biologia é canhota Carbono alfa Glicina não tem isomeria óptica

Grupo R apolar e alifáticos

• • • • • • Aminoácidos apolares e hidrofóbicos Ligações de Van der Waals Ala, Val, Leu, Iso – Interações hidrofóbicas Gly; menor aminoácido Met – Possui átomo de enxofre Pro – Iminoácido, menor flexibilidade estrutural

Grupo R aromáticos

• • • • Aminoácidos hidrofóbicos Tirosina pode formar pontes de hidrogênio com a água

Modificações pós traducionais

– Fosforilação do OH da tirosina Fenilalanina – Mais apolar

Grupos R polares, não carregados

• • • • Solubilidade intermediária em água Serina e treonina – Grupos hidroxil Asparagina e glutamina – Grupo amida Cisteína – Grupo sulfidril –

Ligações dissulfeto

Grupos R carregados

• Aminoácidos básicos – – Carga positiva Lisina, segundo grupo amino – – Arginina, grupo guanidina Histidina, grupo aromático imidazol • Aminoácidos ácidos – – Carga negativa Possuem segundo grupo ácido carboxílico

Aminoácidos incomuns

• Modificações pós-traducionais – 4-hidroxiprolina – 5-hidroxilisina – 6-N-metil-lisina – Gama-carboxiglutamato – Fosforilação de resíduos • Selenocisteína – Selênio ao invés de enxofre na Cys – É adicionado durante a tradução por mecanismo específico e regulado

pH e pKa

• Constantes de dissociação dependem do pH do meio e são diferentes para diferentes moléculas • Ionização • < pH; > [H] + estado não-ionizado

Aminoácidos são ionizáveis

• Substâncias anfóteras: possuem natureza dual • Podem funcionar assim como ácidos ou bases – Doam ou recebem prótons

Titulação de um aminoácidos

• pKa: tendência de um grupo fornecer um próton ao meio • Aminoácidos podem perder até 2 prótons para o meio • Conclusão: a função das proteínas depende do pH ao qual estão submetidas

Curvas de titulação predizem a carga elétrica dos aminoácidos

• Alguns aminoácidos podem ter átomos ionizáveis também em sua cadeia lateral

Peptídeos e proteínas

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Polipeptídeo

>Insulina [Homo sapiens] MALWMRLLPLLALLALWGPDPAAAFVN QHLCGSHLVEALYLVCGERGFFYTPKT RREAEDLQVGQVELGGGPGAGSLQPLA LEGSLQKRGIVEQCCTSICSLYQLENY CN

Peptídeos tbm são ionizáveis

• Ou seja, possuem curva de titulação característica • Funcionam em faixas de pH ótimas

Número de resíduos por proteína

Uso de aminoácidos

• Varia bastante entre as proteínas • Não permite predizer com precisão o comportamento molecular da molécula

Proteínas com outros grupos químicos

• Adicionados pós-traducionalmente

Trabalhando com proteínas

Prof. Dr. Francisco Prosdocimi

Proteínas podem ser separadas e purificadas

• Sabendo que a célula possui milhares de proteínas, como purificar uma única delas?

– Basta selecionar por propriedade • Tamanho, carga e propriedades de ligação • Obter o extrato bruto – “correr” em cromatografia de coluna • Fase estável (matriz) • Fase móvel (solução com tampão) – Coluna maior permite maior resolução na separação

Cromatografia por troca iônica

• Polímero carregado negativamente – Proteínas positivas ligam ao polímero e demoram mais a ser eluídas da coluna • Afinidade da proteína é definido também pelo pH

Cromatografia por exclusão de tamanho

• Grânulos porosos na matriz seguram as moléculas menores • Moléculas grandes não entram nos poros e são eluídas primeiro

Cromatografia de afinidade

• Adiciona-se à matriz da coluna algum tipo de molécula ligante da molécula de interesse • Molécula ligadora de ATP; adiciona-se ATP à matriz • Elui-se com solução de ATP

Eletroforese -- Histórico

• • • • • 1952, Markham and Smith – Ao estudarem hidrólise de RNA percebem que moléculas de diferentes estruturas têm sua mobilidade diferenciada quando aplicadas num papel e submetidas a um campo elétrico 1955, Smithies – Géis de amido funcionam bem para separar proteínas do soro humano 1967, Loening – Géis de acrilamida com maior resolução e permitem separar ainda moléculas grandes de DNA 1980, Schwartz and Cantor – Eletroforese em campo pulsado separa fragmentos enormes É hoje impossível imaginar um laboratório de biomol sem eletroforese acontecendo a todo instante...

Tenho que ir senão vou perder meu gel Vou ali correr um gelzinho e já volto

Eletroforese

• Movimento de partículas dispersas num fluído sob influência de um campo elétrico uniforme • DNA, carga negativa – Tem tendência a se dirigir ao polo positivo quando sujeito a um campo elétrico • Serve para separar moléculas por tamanho/carga elétrica – Proteína deve ser desnaturada com detergente (SDS) • Técnica utilizada à exaustão em trabalhos de biologia molecular

Eletroforese, etapas

1.Preparação do gel 2.Aplicação das amostras 3.Eletroforese

4.Coloração 5. Análise dos resultados

Preparação do gel

Horizontal X Vertical Agarose X Poliacrilamida

Aplicação das amostras

Definição do mapa das amostras por canaleta

Corrida do gel

• Aplicação do campo elétrico • Fonte elétrica gera fluxo de íons através da solução tampão • Terminais positivo e negativo • Tempo adequado, senão o DNA sai do gel

Coloração das moléculas

• • • Prata – Gel SDS-PAGE • PoliAcrilamide Gel Electrophoresis – Melhor resolução Coomassie blue, etc Brometo de etídio – Agente intercalante do DNA • Cancerígeno!

– – Composto fluorescente à luz UV Gel de agarose

Eletroforese de um resultado de cromatografia

O marcador de peso molecular

• • Comprado de uma empresa – Possui proteínas de peso molecular bem conhecido Permite saber o peso molecular da(s) proteína(s) presente(s) numa amostra

Geis bidimensionais

• Corre-se o gel normalmente em uma dimensão... E depois vira se-o e corre-se em outra dimensão • Cada ponto representa aproximadamente uma proteína original presente na amostra – Maiores géis dão maiores resolução

• •

Proteínas não separadas podem ser quantificadas

Deve-se saber qual o substrato que a enzima usa Deve-se poder medir o produto da ação enzimática • Uma unidade de enzima digere 1μmol de substrato por minuto a 25ºC

Estrutura primária das proteínas

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Níveis estruturais das proteínas

As estruturas primárias das proteínas são conhecidas

• Para todos os genomas sequenciados, conhece-se a estrutura primária de todas as proteínas para este organismo • As pontes dissulfeto podem se formar entre diferentes cadeias protéicas – E principalmente dentro da mesma

Sequenciamento de peptídeos

• Degradação de Edman – Marca e remove apenas o resíduo N-terminal • Método ineficiente, permite sequenciamento de pequenas porções das moléculas • Sequenciamento do RNAm é muito mais simples e preciso; permite sequenciar proteínas enormes – como a titina

Produção de peptídeos

• Purificação a partir de tecidos • Engenharia genética • Síntese química direta

Alinhamento de sequências

• Os organismos possuem, em grande medida, as mesmas proteínas (ortólogas) – Derivam do ancestral comum entre os organismos • O alinhamento permite que identifiquemos as porções mais importantes (conservadas) da proteína

Evolução molecular

• Quanto mais similares as sequências das proteínas dos organismos, mais próximos eles são evolutivamente

Árvore molecular da vida

Conclusões

• • • • • • Diferentes características químicas das cadeias laterais dos aminoácidos definem características de peptídeos e proteínas Os resíduos de aminoácidos são ligados às centenas ou milhares para formar peptídeos e proteínas As proteínas podem ser modificadas pós-traducionalmente As proteínas podem ser separadas por carga, tamanho e afinidade e assim estudadas isoladamente – cromatografia e eletroforese As proteínas podem ser sequenciadas e sua estrutura primária (seq. de aminoácidos é conhecida) As sequências das proteínas são excelentes marcadores da evolução da vida na terra