Transcript - Unishare
BIOFILMS ON MEDICAL DEVICES Colonizzazione cute Migrazione tratto sottocutaneo Colonizzazione punta CVC COMMENSALI della pelle: Staphylococcus epidermidis, S.aureus Corynebacterium spp COMMENSALI del tratto intestinale: Escherichia coli Klebsiella, Enterococcus Batteri ambientali: Pseudomonas aeruginosa Sphyngobacterium spp Stenotrophomonas spp COOMENSALE delle mucose: Candida albicans 5 milioni di CVC impiantati ogni anno 250.000 infezioni associate a cateteri 12%- 25% mortalità Aumento della spesa ospedaliera da 3000$ a 56167 $ per paziente American College of Critical Care Medicine e della Society for Healthcare Epidemiology of America Superficie di catetere sterile Film proteico depositato sulla superficie del CVC Superficie di catetere colonizzato da Staphylococcus epidermidis ESEMPIO: Central Venous Catheters greatest risk of device-related infection infection rates of 3 to 5%. Biofilms are universally present on CVCs biofilm development: outside of the catheter or inner lumen Colonization and biofilm formation may occur within 3 days of catheterization Metodi utilizzati per la determinazione quantitativa della popolazione microbica adesa a superfici rigide Metodi diretti: Metodi indiretti: conta UFC di batteri eluiti microscopia ottica con mezzi fisici elettronica (trasmissione, scansione) colorazione batteri adesi e confocale successivo saggio del colorante eluito radiomarcatura biologici Svantaggi presentati dai vari metodi: impossibilità di distinguere tra cellule vive e morte possibile alterazione integrità cellulare possibile morte di parte della popolazione batterica distacco non garantito di tutte le cellule impiego di sostanze tossiche decadimento e diluizione dell’isotopo radioattivo necessità di curve di correlazione per ogni microrganismo METODI DIRETTI • MICROSCOPIA OTTICA • MICROSCOPIA ELETTRONICA • MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE • MICROSCOPIA A FLUORESCENZA • MICROSCOPIA CONFOCALE MICROSCOPIA OTTICA VANTAGGI SVANTAGGI E LIMITI • Facilità di esecuzione • Non distingue Vivi/Morti • Porzioni di materiali Mai diagnostica, mai predittiva, sempre complementare MICROSCOPIA ELETTRONICA VANTAGGI • • • Caratterizzazione strutture di adesione Localizzazione antigeni Visualizzazione di un fenomeno SVANTAGGI E • • • • • • • LIMITI Non distingue Vivi/Morti Natura del materiale Porzioni di materiali Artefatti Non facile ANALISI QUALITATIVA NON SU BIOMATERIALI MICROSCOPIA ELETTRONICA A SCANSIONE VANTAGGI SVANTAGGI E • • • • • • Dettegli sull’attaccamento microbico Osservazione anche del materiale opaco SOLO QUALITATIVA LIMITI Non distingue Vivi/Morti Solo porzioni di materiale Non facile MICROSCOPIA A FLUORESCENZA (CTC, ARANCIO DI ACRIDINA, DAPI, RODAMINA 123) VANTAGGI SVANTAGGI E LIMITI • • Distingue Vivi/Morti con colorazioni differenziali (BacLight Live/Dead) Incubazione/Preparazione del campione SYTO9: COLORANTE CATIONICO LIPOFILICO CHE PENETRA ATTRAVERSO LE MEMBRANE E MARCA I BATTERI VIVENTI CON UNA FLUORESCENZA VERDE IODURO DI PROPIDIO: COLORANTE ANIONICO CHE NON PENETRA LE MEMBRANE. SE LE MEMBRANE SONO DANNEGGIATE O COMPROMESSE (BATTERI UCCISI) PENETRA E MARCA CON UNA FLUORESCENZA ROSSA MICROSCOPIA CONFOCALE VANTAGGI SVANTAGGI • Illuminazione laser • Materiale opaco e trasparente • Non evidenzia interazioni Interno/Esterno materiale • Solo porzioni di materiale METODI INDIRETTI PER LA DETERMINAZIONE DI MICRORGANISMI ADESI Metodi di conta con distacco dei batteri METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE METODO DI CLERI METODO DI SHERETZ Metodi di conta in situ MARCATURA CON ISOTOPI SAGGI IMMUNOENZIMATICI SAGGI BIOLOGICI Qualitativo Coltivazione in brodo di punta del catetere Vantaggi Grande semplicità Grande sensibilità Svantaggi Non discriminante tra contaminazione colonizzazione infezione Non garantito lo sviluppo di tutte le specie presenti Impossibilità di determinare se presente più di una specie Necessaria la rimozione del catetere METODO DI MAKI O ROLL TECHNIQUE Ampiamente utilizzato per cateteri venosi Semina mediante striscio su opportuni terreni solidi Semiquantitativo Sviluppo di: <15 colonie Contaminazione >15 colonie Colonizzazione Rotolamento di punta del catetere su piastra per 4 volte Vantaggi Svantaggi Grande semplicità Bassa specificità Bassa predittività Facilità di esecuzione Microrganismi vivi Non garantito il distacco dei batteri Coltivazione della sola porzione esterna del catetere Necessaria la rimozione del catetere METODO DELLA SONICAZIONE Distacco dei microrganismi adesi o mediante sonicazione o vortex Semi-quantitativo (CRI) Coltivazione della punta e del segmento distale del catetere Vantaggi Sonicazione, vortex Microrganismi vivi Sensibilità alta Facilità di esecuzione <102 colonie Sviluppo di: Contaminazione >102 colonie Colonizzazione Svantaggi Non garantita la vitalità ed il distacco dei batteri Non distingue tra colonizzatori parte esterna e lume Necessaria la rimozione del catetere SAGGI IMMUNOLOGICI ELISA VANTAGGI • No radioattivo SVANTAGGI E • • • • • LIMITI Conoscenza del microrganismo Espressione dell’antigene Semi-quantitativa Microrganismi in superficie Antigene nella forma plantonica è espresso? • Curve di riferimento Metodi biologici Correlazione tra un fattore batterico (ATP, consumo di O2, produzione di CO2, ecc.) e numero di batteri VANTAGGI • No radioattivo • Indipendente dallo stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm) • Distingue vivi da morti • Nessuna manipolazione del supporto abiotico SVANTAGGI E LIMITI • Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC Contenuto di ATP e numero di batteri VANTAGGI • Indipendente dallo stato del microrganismo (plantonico/sessile/biofilm) • Distingue vivi da morti SVANTAGGI E • • LIMITI Curve di riferimento con metodo della conta delle UFC Rottura dei batteri non sempre efficace Correspondence curves between log CFU-per-milliliter and log relative light unit (RLU) mean values IL METODO BIOTIMER Consente di determinare il numero di batteri adesi, aggregati o in biofilm, mediante un test biochimico e non mediante la classica determinazione del numero delle unità formanti colonia (UFC) Il BioTimer utilizza un terreno di coltura contenente un indicatore di pH (rosso fenolo), che vira dal rosso al giallo in seguito all’acidificazione del terreno Il tempo richiesto per il viraggio dell’indicatore viene correlato con il numero di cellule batteriche presenti inizialmente nel campione attraverso una curva di correlazione specifica Il nuovo metodo consente di determinare il numero di batteri in situ, senza manipolazione del campione Ceppi utilizzati Streptococcus sobrinus ATCC33478T Streptococcus oralis ATCC35037T Escherichia coli MG1655 ATCC47076 Staphylococcus aureus ATCC6538 Pseudomonas aeruginosa PAO1 Esempi di curve di correlazione tra tempo di viraggio dell’indicatore e numero dei batteri presenti nel campione Log UFC 8 Streptococcus sobrinus y = -0,3056x + 8,2608 7 6 Log UFC 5 8 Streptococcus oralis y = -0,301x + 9,0615 7 4 4 Log UFC 5 6 7 8 8 9 10 11 12 13 14 Staphylococcus aureus 6 5 y = -0,5443x + 8,5446 7 4 6 6 7 8 9 10 11 12 13 Tempo (ore) 5 4 1 2 3 4 5 6 7 8 Tempo (ore) 14 Metodi di valutazione dell’attività degli antibiotici in vitro 1 METODI PER DILUIZIONE in TERRRENO LIQUIDO o SOLIDO 2 METODI PER DIFFUSIONE in TERRENO SOLIDO MIC Concentrazione Minima Inibente MBC Concentrazione Minima Battericida SOLO PER BATTERI IN FORMA PLANCTONICA !!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!! NON IDONEO PER BIOFILM Calgary device Sistema per la determinazione della minima concentrazione per l’eradicazione del biofilm (MBEC) National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) APPLICAZIONE DEL BIOTIMER NELLA DETERMINAZIONE DIRETTA DELLA SUSCETTIBILITA’ AGLI ANTIBIOTICI DA PARTE DI BATTERI ADESI IN BIOFILM A CATETERI NESSUNA MANIPOLAZIONE DEL CAMPIONE !!!!!!!!!!!!!