Transcript презентацию

Иммунологические маркеры развития
перинатальных инфекций
Долгих Т.И., Шелев М.В.,
Тирская Ю.И., Белкова Т.Н.
Инфекционная перинатальная патология
За последние 7 лет в г. Омске:
Отмечается рост перинатальных потерь с увеличением
доли инфекций в их структуре (увеличение показателя
несостоявшегося выкидыша с 7,3 до 8,8 на 100 родов)
Отмечается высокий уровень антенатальной смертности
(среднемноголетний показатель 4,9 на 1000 родившихся
живыми и мертвыми).
На фоне снижения младенческой смертности остается
высокой младенческая заболеваемость. Отмечается
выраженный рост заболеваемости внутриутробными
инфекциями доношенных новорожденных (Тпр.=9,0%;
р<0,05).
Возросла частота случаев задержки внутриутробного
развития плода (ЗВУР) .
В формирование перинатальной патологии значительный
вклад вносят герпесвирусы с повышением значимости ВЭБ,
ВГЧ 6 типа, вирусно-бактериальных ассоциаций.
Инфекционная перинатальная патология
Преобладание малосимптомного течения перинатальной
инфекции осложняет постановку диагноза.
Продолжается поиск эффективных маркеров реализации
внутриутробной инфекции у плода и новорожденного
Необходимо
разработать
методологическую
основу
регионально
ориентированной
программы
эпидемиологического
мониторинга
за
инфекционной
перинатальной патологией.
Целесообразна разработка тактики ведения женщины и
новорожденного на основе персонифицированного подхода
к мониторингу и терапии.
Цель:
разработка
диагностических
и
прогностических
критериев
развития
внутриутробной инфекции для оптимизации
диагностики и лечения женщин и новорожденных с
данной патологией
Консенсус между специалистами
по вопросам диагностики: как его достичь?
1. Работать вместе над решением клинических задач;
2. Знать и рационально использовать потенциал
лаборатории.
Клиницисту надо решить: что исследовать, для
чего и каким методом?
КАЖДОМУ ТЕСТУ – СВОЕ МЕСТО!
Медицинской сестре и лаборанту – обеспечить
преналитическйи этап
Специалисту КДЛ – предложить оптимальный
алгоритм, обеспечить достоверность и быстроту
выполнения анализа, оказать помощь в
интерпретации результатов
Возможности лаборатории
 Использование микробиологических
методов:
- Бактериологический посев на микрофлору
- Бакпосев на грибы с определением чувствительности
 Внедрение новых лабораторных технологий:
- ПЦР, ИФА, РИФ, в т.ч. на основе биочипов
- Иммунохимические метод
- Иммуноблот (Line-blot)
 Широкое внедрение бесприборных методов
диагностики
 Возможность одновременной и оперативной
комплексной диагностики группы инфекций
 Оценка иммунорезистентности с помощью
проточной цитометрии и уровня цитокинов
Фенотипирован
ие клеток
Метод (Цель)
Методы, направленные на
этиологическую
расшифровку
Оборудование
Реагенты
ПЦР (ДНК)
Терцик - «ДНК-технология»
АЛА-1/4 - «Biosan» (Латвия)
«Амплисенс», ФГУН ЦНИИЭ
Эпидемиологии (Россия)
РИФ (антигены,
«ранние белки»)
Микроскоп люминесцентный
«Carl Zeiss» (Германия)
«VIRCELL microbiologists»
(Испания)
ИФА -анализатор «Elisys
Quattro» - (HUMAN, Германия);
планшетный спектрофотометр
«Multiscan EX» (Финляндия)
ЗАО «Вектор-Бест» и НПО
«Диагностические системы»
(Россия),
ИФА
(специфические
IgA, IgM, IgG, IgGИА), ИБ
«EUROIMMUN»
(Германия)
Бактериологический Спектрофотометр «Multiscan
EX» (Финляндия)
Иммунологические методы
Проточный
цитофлюориметр «Beckman-Coulter» (США)
Проточная
цитофлюориметрия «FC-500» (США)
Нефелометрия
Определение
цитокинов
Genital system® и Vagicult®,
(Италия)
уровня ИФА (IL)
Анализатор белков
Plus» (Финляндия)
«Turbox «Orion
(Финляндия)
Diagnostica»
Планшетный спектрофотометр ООО «Протеиновый контур»,
«Multiscan EX» (Финляндия)
ЗАО «Вектор-Бест» (Россия)
Проточный
лазерный «Human Cytokine
Проточная
флюориметрия (IL- иммуноанализатор «BIO-PLEX («BioRad», США)
200»
27 plex)
27-plex»,
Степень активации клеточного иммунитета
Степень активации клеточного иммунитета
HLA-DR – активация
иммунных клеток.
Возможные комбинации: CD3+/
HLA-DR, CD4+/ HLA-DR, CD8+/
HLA-DR, CD14+/ HLA-DR,
CD5+/19+/ HLA-DR
Герпесвирусные инфекции: лабораторная диагностика
Исследуемый материал
Метод
Назначение метода
Этиологическая расшифровка HSV-1\2-, CMV-, EBV-, HHV-6 -инфекций
- Соскобы из очага
инфекции
(глаза, зев, уретра,
цервикальный
канал, кожные покровы)
ПЦР
- Лейкоцитарная взвесь
РИФ
- Ликвор (при поражении
мозга)
- Ткани элиминированных
плодов
- Плацента
_________________________
- Сыворотка крови (ИФА, ИБ)
ИФА
Иммуноблот
Детекция ДНК
вирусов
Выявление
антигенов
Вирусов
- IgM, IgG, ИА- IgG
- IgA (!)
- Антитела к
белкам вируса (ИБ)
- В ликворе IgG
(LSQ/CSQ)
Токсоплазмоз (лабораторная диагностика)
Исследуемый
материал
Назначение метода
Метод
Этиологическая расшифровка
Кровь,
ликвор,
биоптаты,
ткани
погибших
плодов,
плацента
ПЦР
или РИФ
ИФА,
Иммуноблот
(фазы I, II, III,IV)
ИФА
(ликвор)
Детекция ДНК /антигенов
Выявление антител: - IgM,
IgA, IgG
- IgG низкоавидные
- IgA и IgG-avidity к ROP1,
MAG1, GRA7,GRA8, SAG1
-
IgG
LSQ/CSQ = IgG/(ликвор) / IgG
(сыворотка) (>1,5 !)
Парвовирусная инфекция В19


Парвовирус В19 – это малого размера ДНК вирус,
который быстро размножается и в основном поражает
незрелые формы эритроцитов.
Исследуемый материал – кровь, ликвор. Основные методы
– ПЦР и ИФА
Заболевание вызывает яркие высыпания на коже
(краснухоподобный синдром) и артропатии,, анемию
и апластический криз.
Трансплацентарная передача возможна в 33%
случаев формирует многоводие, водянку плода,
тяжелые анемии, поражение миокарда. Возможна
внутриутробная гибель плода
(в 25% случаев)
Может приводить к прогрессирующей гидроцефалии
(из ликвора выделяется ДНК парвовируса В19)
(журнал «Детские инфекции», 2010. - № 4).
Объем исследований
I . Исследование плаценты женщин, родивших детей с
ВУИ (n=598)
II . Исследование тканей погибших эмбрионов/плодов
(n=746)
III. Комплексное поэтапное обследование женщин с
внутриутробной гибелью плода
IV. Обследование женщин с преэклампсией различной
степени тяжести с наличием инфекции (n=115)
V . Обследование новорожденных с ВУИ и гипоксией
мозга (n=104)
V I. Обследование пар «мать-ребенок» (n=302)
Женщины, родившие детей с ВУИ: результаты
исследования плаценты (ПЦР; %)
90
Str.pyogenes
80
Str.agalact.
70
Listeria
60
50
40
30
T.gondii
Rotavirus
PV B19
EBV
CMV
20
HSV1,2
10
Rubella
0
Внутриутробная гибель плода
1.
В формировании патологии плода в I триместре
беременности установлена наиболее важная роль
принадлежит бактериальной микрофлоры (Staph., E.coli),
во II триместре – U.urealyticum (в виде микст-инфекции), в
III триместре – вирусам.
2.
Listeria встречается с частотой 17% и 20% при гибели плода
в I и во II триместрах.
3.
Во II триместре микст-инфекция вызывает гибель плода в
60,05% случаев (в 1,6 раза чаще, чем в I триместре).
4.
Установлена роль вирусов: EBV (22,5% и 16,7%), CMV (16,2%
и 13,5), HSV-1/2 (12,3% и 10,3%), Rotavirus (28,5% и 15,6%),
Rubella (14,6% и 9,8%), PV B19 (3,2% и 9,5%) – в I и во II
триместрах
5.
ДНК T.gondii обнаружена в 12,4% и в 17,5%.
Женщины с внутриутробной гибелью плода
1 этап – оказание неотложной помощи и установление
факторов риска* (стационар):
Прогностические критерии развития системной
воспалительной реакции:
снижение уровня РАИЛ, ИЛ-10 и бактерицидного
гуморального фактора лактоферрина (при вирусной и вируснобактериальной инфекции) при неизмененном уровне
провоспалительных цитокинов - ФНО-α и ИЛ-1β.
Повышение концентрации РАИЛ в течение первых суток
после элиминации погибшего эмбриона/плода является
критерием гнойно-воспалительного поражения плодного яйца и
децидуальной ткани, что требует проведения адекватной
стандартной терапии с учетом биотопа половых путей
женщины.
__________________________________________
* - Утверждена медицинская технология
Женщины с внутриутробной гибелью плода
1 этап – оказание неотложной помощи и
установление факторов риска* (продолжение):
наличие мертвого плода 5 недель и более (ведущий фактор);
 наличие вирусно-бактериальной или бактериальной
инфекции;
повышенное содержание D-димера и гомоцистеина.
Разработана тактика ведения женщин, основанная на
применении неинвазивных методов удаления внутриутробно
погибших
плодов
с
использованием
препаратов
(простагландин Е2 и F2α), что позволило снизить количество
органоуносящих операций в 5 раз и предотвратить
материнскую смертность
__________________________________________________
Клинико-лабораторный мониторинг и прегравидарная
подготовка
2 этап (амбулаторно-поликлинический)
• Выявление причинно-факторных связей у женщин с
невынашиванием.
• Расширенная этиологическая расшифровка.
• Клинико-лабораторный мониторинг с оценкой системы
гемостаза и определением полиморфизмов генов системы гемостаза
и врожденного иммунитета.
• Оценка интерфероновой системы (при герпесвирусных
инфекциях)
• Коррекция
нарушений
и
адекватная
прегравидарная
подготовка.
Результаты:
Привело к снижению преждевременного прерывания
беременности в 3,7 раза (до 18,7%), антенатальной
гибели плода – в 79 раз (до 0,8%).
_________________________________
* - Утверждена медицинская технология «Тактика ведения
беременных с синдромом потери плода (клинико-лабораторное
обоснование)»
VI . Иммунологические факторы при
преэклампсии
При обследовании 115 беременных с
преэклампсией установлено наличие достоверной прямой
связи уровня провоспалительного цитокина TNF-α и IFN-γ:
со степенью тяжести преэклампсии (r = 0,38 и r = 0,46
соответственно);
с уровнем панкреатической амилазы (r = 0,35 и r = 0,53
соответственно);
с уровнем панкреатической липазы (r = 0,37 для TNF-α);
с уровнем D-димеров (r = 0,37 и r = 0,41 соответственно);
с активностью АЛТ и АСТ (r = 0,39, r = 0,37 и r = 0,59, r = 0,43
соответственно).
При вирусно-бактериальной микст-инфекции имеются более
выраженные нарушения со стороны цитокиновой системы,
системы гемостаза, печени и поджелудочной железы
Дополнительные лабораторные тесты при
преэклампсии
Резюме:
1. Одним
из факторов, способствующих усугублению
преэклампсии, является повреждение поджелудочной
железы за счет усиления процессов перекисного окисления
липидов и оксидативного стресса, что может быть
обусловлено падением антиоксидантной защиты.
2. Усугублению панкреатической дисфункции и, возможно,
панкреатита с ферментативной токсемией, по-видимому,
способствует и сдвиг продукции цитокинов в сторону
провоспалительных.
3. У беременных с тяжелой степенью уровень TNF-α и IFN-γ
имеет достоверную связь с основными клиниколабораторными показателями и уровнем панкреатической
амилазы и липазы на фоне снижения антиоксидантной
защиты
IV. Женщины, родившие детей с ВУИ
Состояние иммунной системы женщин данной
группы характеризовалось:
 достоверным повышением содержания
лимфоцитов с фенотипом CD3+/ CD16+ CD56+,
CD3+/CD4+ и снижением CD3+/CD8+
Высокий уровень Т-NK отмечался у женщин при
гематогенном пути инфицирования герпевирусами
Повышением уровня провоспалительных
цитокинов (TNFα, IL-1β)
Снижением уровня противовоспалительных
цитокинов (IL-10)
V. Реализация ВУИ у новорожденных
Доказано наличие напряженности иммунитета у
детей с верифицированной инфекцией уже в
периоде
внутриутробного
развития,
причем
развитие
иммунного
ответа
формируется
в
основном за счет компонентов врожденного
иммунитета – цитокинов.
Наиболее значимыми критериями реализации
внутриутробной
инфекции
у
новорожденных
независимо от срока гестации является уровень
активированных
моноцитов
и
хемокина
интерлейкина-8.
Уровень цитокинов в плазме крови новорожденных с ВУИ (2А) и
новорожденных с перинатальным поражением мозга гипоксического генеза
(2Б), пг/мл
Распределение лимфоцитов периферической крови с
использованием моноклональных антител против СD14 и
CDHLA-DR, меченых FITC и PE, в группах 1А и 1Б (%).
VI. Стратификация риска развития ВУИ
Включает оценку прогностических факторов:
1. Осложненный акушерско-гинекологический анамнез:
•самопроизвольные аборты,
•неразвивающаяся беременность,
•рождение детей с врожденными аномалиями или ВУИ,
•преждевременные роды,
•перинатальная гибель плода.
2. Наличие очагов экстрагенитальной инфекции:
•мочевыделительной системы (хронический пиелонефрит, цистит).
3. Наличие вирусно-бактериальной инфекции и активной
герпесвирусной инфекции.
4. Осложненное течение гестационного процесса:
•рецидивирующая угроза прерывания беременности,
•воспалительные заболевания нижнего отдела гениталий,
•наличие хориоамнионита в родах
Стратификация риска развития ВУИ (продолжение)
Ультразвуковые маркеры ВУИ :
задержка развития плода в сочетании с изменением количества околоплодных
вод,
множественные кальцинаты плаценты,
утолщение плаценты,
взвесь в околоплодных водах,
нарушение плодово-плацентарного кровотока,
многоводие/маловодие.
5. Иммунологические маркеры реализации ВУИ :
Повышение провоспалительных цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8, IL–6),
Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10, IFN-γ
6. Предикторы развития осложнений при беременности :
• Нарушения в системе гемостаза
• Повышение уровня цитокинов (IL–1β, ФНО, IL–8) и лактоферрина,
• Снижение продукции противовоспалительного цитокина IL–10 и IFN-γ
• Повреждение поджелудочной железы (ферментемия)
ВЫВОД:
Наиболее значимыми критериями развития ВУИ (p*16<-0.05) являются:
бактериальный вагиноз + воспалительные заболевания органов малого таза;
утолщение плаценты + синдром задержки развития плода;
вирусно-бактериальная микст-инфекция;
повышение IL–1β >19,25 pg/ml и ФНО > 24,35 pg/ml.
Установлены маркеры риска развития ВУИ (данные по программе R_MED)
Количественные:
Т-лимф CD3+
p=0.052 Среднее: 64.45, 69.570 C
Т-хел CD3+ CD4+
p=0.001
Среднее: 28.323, 37.558 M-У
Молекулы адгезии
p=0.019
Среднее: 51.85, 66.1 C
ИРИ
p=0.001
Среднее: 0.9483, 1.4929 M-У
IgG
p=0.043
Среднее: 9.95, 13.333 M-У
ИЛ-10
p=0.065
Среднее: 2.2115, 5.3538 M-У
ИЛ-1β
р=0.0019
Среднее: 507, 229 М-У
ИЛ-8
р=0,003
Среднее: 64.4, 52.5 М-У
ФНО
р=0,001
Среднее: 61.1, 47.2 М-У
Категориальные:
Кольпит
0
1
ВУИ
Кольпит
0
1
ВУИ
0
8
8
0
-0,76
1,05
1
9
1
1
0,96
-1,32
"p= 0.080
Методы
статистического анализа:
1.построение «дерева решений»:
2.линейного дискриминантного анализа
3. метода опорных векторов
Свидетельство о регистрации программы для ЭВМ № 2011614225
«Статистический анализ клинико-лабораторных данных для
прогнозирования риска развития патологии (R_MED)»
С помощью прогностической таблицы рассчитывается риск ВУИ в баллах
Менее 13 баллов:
низкий риск
Более 13 баллов – высокий риск
Исследование содержания
цитокинов IL-1β, ФНО
Низкий риск:
ФНО<24,35 pg/ml;
IL-1β<19,25 pg/ml
Высокий риск
(ФНО>24,35 pg/ml ; IL-1β>19,25 pg/ml )
Профилактика плацентарной
недостаточности
Расширенный спектр
лабораторных исследований
для верификации возможных патогенов
При отсутствии возбудителя:
профилактика ПН
При верификации возбудителя
этиотропное лечение, профилактика ПН
Здоровый
ребенок
Здоровый
ребенок
Внутриутробное
инфицирование
ВУИ
Алгоритм ведения недоношенных новорожденных
(из группы высокого риска по ВУИ)
оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения
(IL-8; IL-1β; лактоферрин)
IL-8: ↓34,92 pg/ml
отсутствие ВУИ
IL-8: ↑34,92 pg/ml
Лактоферрин
Лактоферрин:
↑346,6 нг/л
риск инфицирования
новорожденного
динамическое
наблюдение
IL-1β
Лактоферрин:
↓346,6 нг/л
риск ВУИ
IL-1β:
↓4,1 pg/ml
риск ВУИ
этиологическая верификация
этиотропное лечение
IL-1β:
↑4,1 pg/ml
риск инфицирования
новорожденного
динамическое
наблюдение
Алгоритм ведения доношенных новорожденных
(из группы высокого риска по ВУИ)
оценка уровня цитокинов в первые сутки после рождения
(IL-8; ФНО)
IL-8: ↑25,57 pg/ml
ВУИ
этиологическая верификация
этиотропное лечение
IL-8: ↓25,57 pg/ml
IL-8: ↓5,69 pg/ml
отсутствие ВУИ
IL-8: 5,69-25,57 pg/ml
ФНО
ФНО: ↑14,37 pg/ml
риск инфицирования
новорожденного
динамическое наблюдение
ФНО: ↓14,37 pg/ml
отсутствие ВУИ
Благодарю за
внимание !
Для контактов: 644001,г.Омск, 20 лет РККА,
д.15.
Телефон: 8(3812)36-23-11, 37-03-55, 37-03-43
E-mail: [email protected]