Transcript Cours6-GenieMetabolique2007

Génie métabolique chez les
végétaux
Utilisation de la transgenèse chez les
plantes dans le cadre de démarches
de génie métabolique
www.imagesdepicardie.com
Génie métabolique

Optimisation des procédés de fermentation
industrielle basée sur la compréhension et la
modulation de voies métaboliques


Conditions de culture
Génie génétique
Définition valable pour seulement pour
des aspects très restreints du génie
métabolique chez les végétaux
Génie métabolique végétal dans le
cadre de cultures en « bioréacteurs »
Masanaru Misawa
Production de métabolites secondaires par
le biais de cultures de cellules ou de tissus
végétaux en bioréacteurs
Ex: Shikonine
« Champs de microbes » : utilisation
industrielle de bactéries photosynthétiques par
l’entreprise Solazyme
Protéines recombinantes
Caroténoïdes
Génie métabolique appliqué aux
« plantes entières »

Productivité




Assimilation des éléments
Tolérance aux stress
Phytoremédiation
Points abordés dans
les cours
Qualité


Augmentation des teneurs
 Vitamines, Principes actifs médicamenteux,
Pigments, Parfums, Arômes, Acides gras
insaturés …
Diminution des teneurs
 Glucosinolates, Acide érucique, Arômes
indésirables, Tannins, Lignine
Génie métabolique appliqué à la
production de composés à usage
pharmaceutique et cosmétique
Principaux métabolites secondaires
utilisés dans l’industrie pharmaceutique
et cosmétique

Alcaloïdes



Composés mixtes et glycosides


Glycosides cardiotoniques
Composés phénoliques


Alcaloïdes indoliques
Etc..
Flavonoïdes, quinones … etc…
Isoprénoïdes

Tocopherol…etc..
Le problème de la production des
métabolites IIaires

Synthèse organique


Culture de plantes au champ


Lorsqu’elle est possible…
Lorsqu’on la maîtrise
Culture in vitro

Lorsque les molécules en valent la
peine…
Synthèse organique : les plantes
comme modèle
•
Souvent possible, à bas prix

Ex : aspirine
Réaction de Kolbe
• Mais, ce n’est pas toujours possible…
Culture de plantes aux champs

Plantes médicinales



~7000 ha en France
Culture peu coûteuse
Mais, ce n’est pas toujours possible…
Exemples de plantes médicinales
difficiles à cultiver
L’if
Pervenche de
Madagascar
Autres organismes biologiques

Expression hétérologue de gènes de
plantes chez d’autres
microorganismes hôtes ?


Caractères fortement polygéniques
Expression étroitement coordonnée de
plusieurs dizaines de gènes dans la
synthèse d’un seul métabolite
Génie métabolique appliqué aux végétaux
Cultures in vitro pour la production
de métabolites secondaires


Un dogme ancien et erroné : « les
suspensions cellulaires ne
produisent pas de métabolites
secondaires » (1940-1970)
Une technologie récente (19751985) et des résultats assez peu
nombreux…
Les espoirs initiaux




1956 : Pfizer inc. Dépose un brevet concernant la
production de métabolites par des cultures cellulaires
de plantes
Fin des années 60 :
 La visnagine et la diosgenine sont produites à plus
fortes concentrations dans des cultures cellulaires
que dans les plantes
Ça « coince » avec les molécules les
intéressantes : vinblastine, vincristine…
Un succès : la Xn de shikonine commercialisée en
1983 par Mitsui Petrochemicals
Japon : la tête de proue


Outils de fermentation industrielle
Extension aux cultures végétales



70s (Japan Tobacco Inc) production de
biomasse pour la confection de cigarettes
(réacteurs de 20 000 L)
Meiji Seika, Nitto Denko Co : production de
masse de Panax ginseng in vitro
1982 : 5ème congrès de l’IAPTC (=IAPB) au
japon : nombreuses avancées dans la
production de métab II, dont la shikonine par
Mitsui Petrochemicals
Lithospermum erythrorhizon (Borraginacées)
http://homepage1.nifty.com
http://crop.nics.go.kr
Cosmétique
Shikonine : 10% de la MS
de la racine
Phytothérapie
Cultures en bioréacteur de cellules de
Lithospermum erythrozhizon
www.uni-tuebingen.de/pharmazie/abteilungen/biologie/de/shikonin.html
Trois succès durables


Shikonine
Berbérine


Cultures cellulaires
Saponines du ginseng

Cultures de racines à grande échelle
Un alcaloïde isoquinolique : la
berbérine


Malaria
Principal alcaloïde accumulé dans le
rhizome de Coptis japonica
(Renonculacée)
Années 70 : selection d’une souche
hyperproductrice de berbérine,
transférée à Mitsui Biochemicals
Optimisation : culture à haute densité
(optimisation de l’oxygénation et du
milieu), 0.45 g /L / jour
http://www48.tok2.com/home/
Production de saponines par
Panax ginseng



Traitement des ulcères
5 ans de culture
Destruction de la racine pour
extraction
www.01sante.com/. ../ginseng.htm
Culture de racines en
réacteur
Quelque systèmes de production à
l’étude


taxol
Vinblastine, Vincristine


Elly Lilly & Co
Glycosides
Concurrence avec la synthèse
chimique
Paclitaxel (taxol)


Écorce de Taxus brevifolia (If du
pacifique)
Propriétés pharmacologiques


Antimitotique tubulo-affine
Applications

cancers à métastases
 Cancer de l’ovaire et du sein
Culture in vitro pour la synthèse de
Taxol

Taxol:


traitement 1g /an
1g = 3 arbres (Taxus sp., l’If) de 150 ans
Productivité in vitro :
100-150 mg / L en deux semaines
Taxus baccata (Taxaceae)
10-désacétylbaccatine III dans les
feuilles : récolte non-destructrice


Précurseur d’hémisynthèse
Toxotère® par Sanofi-Aventis
Catharanthus roseus (Apocynaceae)
Le thé de pervanche utilisé en
pharmacopée traditionnelle en Jamaïque
comme antidiabétique
Années 50 :
Stimulation de la sécrétion d’insuline ??
http://www.ntbg.org/plants/plantresource
Pas du tout mais diminution
des globules blancs
Traitement des leucémies
Vinblastine et vincristine
Maladie de Hodgkin
Leucémies
Faible rendements …
•Vinblastine : 2-10 g (50-250 k€) / tonne de MS
•Vincristine : 0.5 g / tonne de MS
Les alcaloïdes de la pervenche de
Madagascar


Au moins 70 alcaloïdes identifiés
dont :
Dans les feuilles


Vincristine et vinblastine
(anticancéreux)
Dans les racines et les suspensions
cellulaires

Serpentine et Ajmalicine :
(antihypertenseurs)
Production d’ajmalicine par C. roseus

Hypothèses :




800 Kg / an
260 µg ajmalicine / g MS / jour
Suspensions cellulaires : 3150 $/Kg
Plantes entières : 619 $ / Kg
Au contraire la culture de Lithospermum est longue
(maturité 3-5 ans) et sensible au variations climatiques :
les cultures cellulaires sont plus rentables
Source : FAO (http://www.fao.org/docrep)
L’hémisynthèse


1974 Équipe de Potier (Paris)
Dimérisation de deux alcaloïdes
monomeriques :

catharantine et vindoline 
vinorelbine (navelbineTM)
ß-methyl-digoxine (Digitalis)

Cardiotoniques


Mais de nouveaux cardiotoniques de
synthèse sont apparus
Les projets de production par CIV sont
tombés à l’eau
Les suspensions cellulaires sont tout de
même utilisées pour réaliser les étapes
finales :bioconversion
Bioconversion
Premières étapes de synthèse
chimique
Finalisation des molécules par culture
in vitro
Amélioration
Ajout de précurseurs dans le
milieu de culture : bioconversion
A
B
C
A
B
C
coût B / coût C ?
Bioconversion

12-hydroxylation de la beta-methyldigitoxine  digoxine
OH
Reinhard et Alfermann 1982
Boehringer Mannheim Co : réacteurs de 4 000 L
Digitalis lanata
Bioconversion des extraits
végétaux



Bioconversion des extraits par fermentation
lactique en réacteur
teneurs en trois ginsenosides d’interêt : X 60
Pathologies causées par Helicobacter pilorii
(ulcères)
Brevet (2003) Ginseng Science
Méthodes de production in
vitro
Du prototype à la technologie
industrielle
Mise au point en flacons de culture
Production in vitro
Principes de base

La plupart des métabolites
secondaires sont intracellulaires,
intravacuolaires
Quantité produite = biomasse produite X
concentration
Production in vitro
• Biomasse
Alors : dX =  dt
X
et ln X =  (t-t0)
Nombre
de cellules
X0
X0
t0
temps
3 semaines
Croissance exponentielle
Production in vitro
• Production de métabolites
Quantité de cellules Quantité de métabolites
secondaires
temps
Découplage croissance/synthèse de Métabolites Iiaires
Exemple : Production d’ajmalicine par
Catharanthus en deux étapes:


L’inoculation de la phase de production avec des
cellules en phase stationnaire avancée donne
une productivité 4 fois supérieure
Indicateur : inoculation avec des cellules qui ont
consommé tout le nitrate dans leur milieu
Schaltmann et al (1996) Biotech. Bioengineering
M9
MG5
Inoculum
Production
Croissance
.
200 L
. 9 .j .
.
750 L
14.j
.
.
.
.
Shikonine
4 g/L
Filtration
Air
Filtration
Air
Procédé de production de shikonine : batch en 2 étapes
Tabata et al.
Mitsui Corp.
Culture en bioréacteurs
http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm
http://www.bioreactor.ru/bioreactor_en.htm
Passage du flacon au réacteur


Dans certains cas : diminution de la
synthèse : Catharantus
Composition de la phase gazeuse:

Taxus:
Baisse de O2  augmentation taxol
 Augmentation CO2  diminution taxol

Mirjalili (1996) Biotechnol Bioengineering
Réacteurs forte capacité

Contrôle des paramètres



pH, O2, nutriments, précurseurs,
éliciteurs…
Agitation, aération
Qualité de lumière
Production in vitro
•Les freins du « scale up »
•Transferts de masse gaz-liquide (oxygène)
• Sensibilité au cisaillement ( 100 t/min)
• Homogénéisation du milieu :
• Sédimentation
• Attachement
• Contact cellules-liquide
Agitation
mécanique
Pales
Tambour
rotatif
Bullage
Wave bioreactors
http://www.wavebiotech.com
Culture d’organes

Dans plusieurs cas, les cellules
indifférenciées ne produisent pas la
molécule désirée:



cellules de Catharanthus : pas de
vinblastine
Cellules de pavot : pas de morphine
Production de saponines par le
Panax ginseng : culture de racines
obligatoire
Culture d’organes

Racines transformées (hairy roots)




Croissance
Production de molécules
Stabilité génétique
Cultures de tiges feuillées
Stratégies alternatives : hairy roots
Hairy roots de Psoralea lachnostachys
Stratégies alternatives : hairy roots
La croissance
« plantes à traire »
•Cultures en
hydroponie
•Solution nutritive en
circuit fermé avec
filtration des
métabolites exsudés
par les racines
INPL-ENSAIA, Nancy
E. Gontier et F. Bourgaud
Datura inoaxia :
Hyoscyamine, scopolamine
(neurosédatifs)
Amélioration
Perméabilisation de cellules
Faire sortir les
produits
intracellulaires
Petite taille moléculaire des métabolites secondaires
 perméabilisation des membranes phospholipidiques
Optimisation de la synthèse
Impact des conditions de culture sur
la synthèse
Elicitation
Comment augmenter la synthèse?


Sélection de lignées fortement productrices
Choix de la source carbonée et ajout de
précurseurs simples

Paramètres physiques et temporels de la culture

Eliciteurs biotiques ou abiotiques

Hormones
Elicitation par un facteur
biotique de la synthèse
de sanguinarine
Un alcaloïde isoquinoléique synthétisé
dans les suspensions cellulaires
d’opium
TYDC
TYDC
TYDC
Elicitation des teneurs en
sanguinarine par l’extrait de Botrytis
Temps après élicitation (h)
Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)
Activité relative
TYDC (%)
Elicitation de l’activité tyrosine
décarboxylase par Botrytis
Temps après élicitation (h)
Facchini et al. 1996 (Plant Physiol.)
L’acide Jasmonique
Un éliciteur « miracle »
Elicitation de la synthèse d’acide
rosmarinique chez Lithospermum
erythrorhizon
Méthyl
Jasmonate
Yeast
Extract
Control
Matsuno et al. 2002 FEBS
Lett.
Matsuno et al. 2002 FEBS Lett.
Utilisation industrielle de l’acide
jasmonique

Elicitation des cellules de Taxus
pour la synthèse de taxol
Fin des années 90 : rendement multiplié
par 100 en particulier grâce au méthyljasmonate
La production industrielle in vitro
devenait alors envisageable
Génie génétique et génie
métabolique
Stratégies moléculaires pour
manipuler des voies de biosynthèse
L’outil moléculaire au service du
génie métabolique




Caractérisation des voies de biosynthèse
Caractérisation des principales étapes
enzymatiques
Clonage des gènes correspondants
Transgénèse

Surexpression
de gènes homologues
 De gènes hétérologues (plantes,
bactéries…)


RNAi
Transgenèse de lignées cellulaires
ou de plantes entières
Système plante entière
insatisfaisant
Système in vitro
insatisfaisant
Souches cellulaires
transformées
Plantes entières
transformées
Stratégie « Étape enzymatique »
Capell et Christou (2004) Curr. Opin. Biotech.
Modulation de la voie synthèse de
la scopolamine chez Hyoscyamus
Häkkinen et al.
Surexpression de la hyoscyamine 6hydroxylase (H6H) et de la putrescine
methyl-esterase (PMT)
PMT + H6H
Témoin
H6H
Témoin racines
transformées par
A. rhizogenes
Zhang et al.
PMT
Stratégie « Facteurs de
transcription»
Moduler l’expression de gènes codant
les enzymes impliquée dans toute
une chaîne de biosynthèse
Stratégie « Facteurs de Transcription »
Catharanthus
Promoteurs régulés
par le facteur de
transcription
ORCA3
Gantet et Memlik 2002
Trends in Pharm Sci
CONCLUSIONS

Production de métabolites 2aires



Quelques réussites en CIV
De gros efforts de recherche depuis 40
ans
L’espoir renouvelé par le génie
génétique
CIV
 Plantes entières

Lecture conseillée pour approfondir les
aspects « bioréacteur »
PLANT TISSUE CULTURE: AN ALTERNATIVE FOR PRODUCTION OF
USEFUL METABOLITE
http://www.fao.org/docrep/t0831e/t0831e00.htm#con
Génie métabolique et
horticulture
Moonshadow (Florigene)
Manipulation de la voie de
biosynthèse des anthocyanes
CHS
F3’5’H
DFR
DFR
F3’H
DFR
Expression de la DFR de maïs
chez le Pétunia


1987 (Nature) Premier succès :
obtention de pétunias oranges
contenant de la pelargonidine
Expression hétérologue d’une DFR
(dihydroflavonol réductase) de maïs
naringenine
F3’5’H
F3’H
DFR de maïs
DFR de pétunia
Comment obtenir une rose bleue ?
(Pari lancé en 1840…)
Les roses sont déficientes en F3’5’-hydroxylases :
pas d’anthocyanes dérivées de la delphinidine
Surexpression de la F3’5’H
Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600
Pour améliorer la qualité du bleu….
F3’5’H
Surexpression de la
F3’5’H de violette
F3’H
Silencing de la DFR de
rose
Surexpression de la
DFR d’Iris
Katsumoto et al. Plant and Cell Physiology 2007 48(11):1589-1600
Génie métabolique et plantes
aromatiques
Biosynthèse du menthol
Amélioration quantitative
et qualitative de l’huile
essentielle de menthe par
génie métabolique
menthol
OH
Trichomes glandulaires chez la menthe
www.microscopix.co.uk/ plants/oils/.
Turner et Croteau (2004) Plant Phy.
Le menthol : un monoterpène
IPP
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
Deux approches

Quantitative


Modulation des activités enzymatiques
en amont de la voie de biosynthèse
Qualitative

Modulation des activités enzymatiques
en aval de la voie de biosynthèse
Plaste
Cytosol
Pyruvate + G3P
DXPS
2 x acétyl CoA
DXR
MCT
Mévalonate
CMK
MECPS
Mévalonate 5diphosphate
2-C-Méthyl-Derythritol-2,4cyclodiphosphate
MDC
Isopentényl IPPI
diphosphate
Diméthylallyl
diphosphate
Terpenoïdes
Goulot
d’étranglement ?
Surexpression de la 1-deoxyxylulose-5phosphate reductoisomerase (DXR)
chez la menthe poivrée
Lignée
Rendement huile (mg/g MF)
Sauvage
1.8
DXR6
2.6
DXR7
2.3
DXR8
2.4
Augmentation de rendement sans
changement de composition
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
Biosynthèse du menthol
Cytochromes P450
(Réticulum)
Leucoplastes
Mitochondrie
Antisens sur la menthofurane synthase
Oil yeald
(mg/g FW)
Limonene
Menthone
Menthofurane
Pulégone
Menthol
sauvage
1.7
2.3
60.2
13.9
7.8
4.0
MFS-as
1.8
2.6
68.8
5.3
2.8
7.3
lignée
Changement de composition sans
changement de rendement
Mahmoud et Croteau (2001) PNAS
Génie métabolique appliqué à
la foresterie
www.nazflora.org
Modification du contenu en
lignine par transgenèse
Principaux constituants du bois
Cellulose (50%)
Lignine (25%)
Hémicellulose
(25%)
(exemple de polymérisation de
quelques unités G)
Problématique

Fabrication de papier


Délignification au sulfate alcalin=procédé kraft
Délignification au bisulfite (acide)

Blanchiment : Chlore, Peroxyde




Ecorçage/Mise en copeaux
Circuit fermé
Effluents
Coût énergétique
Impact environnemental
La lignine : un facteur majeur de difficulté
dans le procédé de fabrication
Hu et al. 1999 Nature
Biotechnology
Augmenter le ratio cellulose/lignine
par génie génétique
Stratégie n°1 : amélioration
quantitative
Répression par
stratégie antisens
Réprimer la 4CL, mais laquelle ?

Chez le peuplier : deux isoformes


Quelles sont leurs spécificités de
substrat?
Dans quels tissus sont-elles exprimées?
Les deux isoformes contribuentelles à la synthèse de lignines ?
Hu et al. 1998 PNAS
Pt4CL2
Pt4CL1
Spécificités de substrat
des deux isoformes de
la 4-coumarate:CoA
ligase
Localisation histologique de l’expression
de Pt4CL1 et Pt4CL2
Hu et al. 1998 PNAS
Activité GUS
Northern Blot
Tiges
Xylème
Feuilles
4CL1
4CL2
Épiderme
Conclusions



La 4CL1 est impliquée dans la synthèse des
monomères de la lignine
La 4CL2 est impliquée dans la synthèse
d’autres composés phénoliques
(métabolites secondaires)
Pour altérer la synthèse des monomères de
la lignine, une stratégie « antisens »
doit être ciblée sur la 4CL1
Contrôle du phénotype : quantité de
lignines
Hu et al. 1999 Nature Biotechnology
% Lignin reduction
Témoin
Transgénique
Témoin
Lignées transgéniques
Hu et al. 1999 Nature
Biotechnology
Phénotype : ratio cellulose / lignine
Implications

Vitesse de croissance accrue



Avantage technologique
Questionnement sur les flux de gènes ?
Effets secondaires possibles de la
diminution des niveaux de lignine


Attaques pathogènes
Décomposition du bois dans la litière 
rôle de puit de carbone pour les arbres
Modifier la composition de la
lignine par génie génétique
Stratégie n°2 : amélioration
qualitative
Bois dur ou bois tendre ?
Lignine G
Lignine S/G
Hu et al. 1999 Nature
Biotechnology
La lignine : un polymère d’unités
phénylpropanoïdes
Liaison moins
résistante : procédé
de fabrication du
papier plus facile
Lorsque la position 5 est
disponible pour la
polymérisation : lignine plus
résistante
Approche retenue:
expression de la F5H
sous le contrôle d’un
promoteur de la C4H
spécifique des tissus du
xylème
% de lignine S dans les transformants
Huntley et al (2003) J. Agric. Food Chem.
Efficacité de la mise en pâte
chimicothermomécanique
Conclusions



Le génie métabolique appliqué à
l’amélioration des espèces ligneuses
horticoles, aromatiques ou médicinales
est une approche crédible
Cette approche ouvre un champ large
d’applications
Plusieurs applications sont déjà au stade
de la commercialisation