Transcript 肿瘤蛋白质组学杨静
主编 李桂源 中国科学院教材建设专家委员会规划教材！ 全国高等医药院校规划教材！ 第四篇 肿瘤分子生物学 第19章 肿瘤蛋白质组学 杨静 博士 二0一二年六月 长沙 肿瘤蛋白质组学 蛋白质组学的概念及其发展史 蛋白质组学的研究方法 蛋白质组学在肿瘤研究中的应用 血液肽组学 蛋白质组学的概念: 人类基因组序列图谱初稿的公布，在揭示基因组的精细结构的同 时，也凸显出基因数量的有限性和基因结构的相对稳定性。 基因组学虽然在基因活性和疾病的相关性方面为人类提供了有力 根据，但是基因的表达方式错综复杂，同样的一个基因在不同条 件、不同时期可能起到完全不同的作用。 研究生命现象，阐释生命活动的规律，只了解基因组的结构是不 够的，还须对生命活动的执行者——蛋白质进行更深入的探讨。 对蛋白质的数量、结构、性质、相互关系和生物学功能进行全面 深入的研究已成为生命科学研究的迫切需要和重要任务，一个以 “蛋白质组”为研究对象的生命科学新时代已经到来。 蛋白质组学的概念: 由澳大利亚学者Williams和Wilkins于1994年首先提出 . “蛋白质组”一词的英文是PROTEOME，它由PROTEins和 genOME两个词组合而成，意思是proteins expressed by a genome ，即基因组所表达的全部蛋白质。 广义上讲，蛋白质组是指“一个细胞或一个组织基因组所表达 的全部蛋白质”。 狭义上讲，蛋白质组是指不同条件下细胞内蛋白质的变化（比 如正常细胞和异常细胞之间，细胞用药和不用药之间的蛋白质 表达谱的差别等） 蛋白质组学的概念: 要对“全部蛋白质”进行研究是非常困难的，“功能蛋白质组学（ functional proteomics)的提出解决了这一难题 功能蛋白质组：细胞在一定阶段或与某一生理现象相关的所有 蛋白质 它是介于对个别蛋白质的传统蛋白质化学研究和以全部蛋白质 为研究对象的蛋白质组学研究之间的层次，并把目标定位在蛋 白质群体上，从局部入手研究蛋白质组的各个功能亚群体，逐 步描绘出接近于生命细胞的”全部蛋白质“的蛋白质组图谱。 蛋白质组学的产生与发展： 1994年，澳大利亚学者Williams和Wilkins首先提出与基因组相对应的“ 蛋白质组”概念。 1996年，澳大利亚建立了世界上第一个蛋白质组研究中心。 同年，丹麦、加拿大也先后成立了国家蛋白质组研究中心。 随后，多个国家加入了蛋白质组研究行列。 1997年，召开了第一次国际蛋白质组会议，预测21世纪生命科学的重 心将从基因组学转移到蛋白质组学，为生命科学和医药学领域的研究 带来了新的生机。 2001年，国际人类蛋白质组组织成立，提出人类蛋白质组计划，相继 启动几个重大国际合作项目。 蛋白质组学的产生与发展（我国）： 1998年启动蛋白质组学研究； 2002年首次牵头组织了人类肝脏蛋白质组计划这一重大国 际合作项目； 2003年成立了中国人类蛋白质组组织，同年召开了首届中 国蛋白质组学大会； 2004年10月在中国北京召开了第三届国际蛋白质组学会 议； 我国在鼻咽癌、肝癌、肺癌、食管癌和白血病蛋白质组研 究方面取得了较大进展。 蛋白质组表达模式的研究方法 样品制备 组织细胞的破碎裂解； 缓冲液的选择； 蛋白质增溶溶解以破坏蛋白质与蛋白质分子之间及蛋白质 与非蛋白质之间的共价与非共价相互作用； 变性及还原； 去除非蛋白质组分如核酸、脂类等。 蛋白质组表达模式的研究方法 蛋白质抽提的原则 尽可能溶解全部蛋白质，打断蛋白质之间的非共价键结合， 使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在； 避免蛋白质的修饰作用和蛋白质的降解作用； 避免脂类、核酸和盐等物质的干扰作用； 蛋白质样品与第一向电泳的相容性； 对临床组织样品的蛋白质的纯化一定要保持其组织细胞的纯 净性，如肿瘤组织中总是与血管、基质细胞等混杂。 组织细胞蛋白质样品的制备 蛋白质一步提取法： 待提取的样品(如肝脏、心脏等） 洗去表面血液及其他体液 样品切成小块并置于液氮中冻结 于研钵内加裂解液研磨 超声波破碎处理 离心，取上清，-70℃保存备用 蛋白质分步顺序提取法：（疏水性蛋白质、低丰度蛋白质） 第一步：细胞裂解，以Tris碱抽 提细胞中的可溶性蛋白质 第二步：第一步未溶解的细胞沉淀用常规 的IEF样品液进行抽提，富集膜蛋白 第三步：采用更有效的表面活 性剂及还原剂进行抽提，使不 溶性蛋白质溶解 如有必要可进行第四步抽提:使与细胞膜 或细胞器中结合很牢的常规提取不能溶 解的膜蛋白质，不溶性蛋白质溶解 脲、CHAPS 脲、硫脲、CHAPS、 SB3-10、TBP SDS、甘油、Tris 细胞蛋白质样品的制备 培养细胞总蛋白质的提取 培养细胞去掉培养基 预冷的PBS漂洗3次 酶消化，收集细 胞于EP管中 加裂解液重悬细胞， 冰上放置30分钟 于瓶中加裂解液， 冰上放置30分钟 收集于EP管中 超声进一步破碎细胞，离心，取上清 细胞蛋白质样品的制备 亚细胞器蛋白质的提取 细胞匀浆 差速离心：1000g,沉淀部分为细胞核；3000g， 沉淀部分为线粒体；16300g，沉淀部分为溶 酶体，上清液为内质网和核糖体部分 密度梯度离心：500g,沉淀部分为细胞核； 15000g，沉淀用不同浓度蔗糖离心获得纯化 的质膜 加裂解液重悬细胞 收集于EP管中 超声破碎细胞，离心，取上清 细胞蛋白质样品的制备 细胞膜蛋白质的提取: 1. 存在于细胞膜或有关细胞器如线粒体、内质网、细胞核等的膜 上，可分为外周蛋白及固有蛋白。 2. 外周蛋白：用含EDTA二钠的缓冲液抽提。 固有蛋白：因其嵌合在脂双层中，抽提时要削弱它与膜脂的疏 水相互作用，因此要通过增溶溶解。常用的去污剂：SDS 、 TritonX-100 、NP-40 、CHAPS 、SB3-10 、ASB等。 细胞蛋白质样品的制备 体液蛋白质（如：血清、血浆、脑脊液、尿液等）: 1. 体液蛋白质分析对于研究疾病的发病机理、疾病诊断、癌细胞转移及 治疗都有重要意义。 2. 绝大多数都属可溶性蛋白质，但也需要做适当处理和增溶溶解，除去 电泳的干扰物才能获得准确的和重复性好的结果。 体液蛋白质样品的制备原则： 1. 尽可能地溶解更多的蛋白质。 2. 必须打断蛋白质的聚合，避免形成点的条纹。 3. 样品制备需重复性好，以免产生错误结果。 样 品 制 备 肿瘤组织总蛋白质的抽提： • 肿瘤组织成分具多样性，且标本的获取过程要考虑多方面的影响因 素，如血液、结缔组织等，它们都含有丰富的蛋白质，对所需的目 的蛋白质会起到干扰作用，故在取材时需尽可能去除间质成分，并 对取得的标本进行清洗以去除血液等。 • 可采用荧光标记的流式细胞仪或激光捕获显微切割术进行取材， 从而获得纯净的蛋白质样品。 •要避开肿瘤组织坏死的部位（多在肿瘤的中央）。 常见蛋白质样品中的污染物及其影响与去除方法 污染物 影响 去除方法 盐，残留缓冲液和样品准 备时混入的带电小分子 引起胶条的高导电性而使 电压下降，导致蛋白质不 能较好聚焦，形成垂直条 带 脱盐：透析、旋转透析、 凝胶过滤、沉淀 内源性分子（核苷酸、新 陈代谢产物、磷脂等） 带有负电荷，影响阳极的 等电聚焦 TCA/丙酮沉淀法去除，亦 可采用上述脱盐法去除 离子型去垢剂（如SDS等） 带负电，影响等电聚焦 使SDS终浓度低于0.25%， 丙酮沉淀法去除 核酸 增加样品粘度，导致背景 条带出现；与蛋白质结合 阻止聚焦 用DNase/RNase来降解； 超速离心去除；超声断裂 多聚糖 易堵塞加样孔，引起蛋白 质沉淀，延长聚焦时间， 并可形成垂直条纹 TCA、硫酸铵沉淀法、高速 离心法去除 脂类 与蛋白质形成复合物，降 低蛋白质的溶解性，并可 影响分子质量及等电点 使用强的变性剂和去垢剂 减少蛋白质与脂类的结合， 丙酮沉淀法可去除脂类 肿瘤蛋白质组学研究方法 样品（实验组和对照组） 凝胶路线 非胶路线 2D-gel SILAC ICAT iTRAQ 2D-PAGE ESI源质谱检测 2D-DIGE MALDI源质谱检测 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 简介： 是近年来最新开发的一种新的蛋白质组学定量研究技术。 iTRAQ试剂盒包括八种同量的胺活性试剂，能对蛋白质水 解的肽段进行标记，因此采用串联质谱方法，可以对肽段 进行精确的鉴别和定量。 能够得到：一般500至600种蛋白，以及不同样品间蛋白质 表达的差异。 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 应用： 同时标记8个样品，一次实验实现多大8个样品的蛋白质鉴定和定量 可以进行多个时间点蛋白质组动态变化的监测 可以分析详细分期/型的临床疾病样本，并看设计样本重复 甚至可以进行个体样本的研究 细胞周期、细胞信号传导整个过程的蛋白质组动态学 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 技术特点和优势： 定量敏感、反应速度快 标记完全，标记效率高（达97%以上） 较高的重复性，能简化图谱的复杂程度、提高离子强度 可对多达八种不同样本同时进行定量分析 定性与定量同时进行 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 原理： iTRAQ试剂包含八种不同的胺活性试剂。每种胺活 性试剂与水解后肽段结合。 胺活性试剂包含报告基团和平衡基团。 同位素相对标记与决定定量技术（iTRAQ技术） 实验流程： 不同的蛋白 质样本用胰 蛋白酶水解 对酶解肽 段进行标 记 混合并做 一级质谱 8个不同来 源的同一 蛋白的同 一个标记 肽段在一 级质谱上 表现为一 个峰 对加入标记的肽 段进行二级质谱， 平衡基团从报告 基团上脱落 报告基团在二级 质谱低质量区域 产生8个报告离 子信号，其强度 分辨代表8个标 记样本的同一肽 段 报告离子的峰面积比值就是同一蛋白质同一肽段在不同样品间的比值 ﹙2﹚对一级质谱的每个峰进行二级质谱（MS/MS):(黄 色部分为报告基团的峰，因为横坐标比较大，没显示 出多条峰） 对质谱仪所得的数据 进行生物信息学分析， 定性和定量研究 蛋白质组表达模式的研究方法 样 品 分 离——蛋白质双向凝胶电泳分离技术 双向凝胶电泳（two-dimensional electrophoresis, 2DE)是最主要的 基于胶的蛋白质组学分离技术 第一向，根据不同蛋白质分子 所带电荷量的差异，以等电聚 焦技术进行分离 第二向，根据蛋白质的分子量 不同，通过SDS凝胶电泳进行 分离 分辨率高，应用广泛 双向电泳技术可分离几千个蛋白质点! 平 衡： 第一向IEF电泳结束后，需向第二向SDS电泳转移。 在转移前都需要经过第二向SDS电泳分离系统溶液进行平衡。 目的：通过平衡液中的DTT或β-巯基乙醇使蛋白质分子中的二硫 键保持还原状态，有利于SDS与蛋白质的充分结合。另外，使等电 聚焦凝胶中的两性载体电解质或固相pH梯度IEF中水化液成分及高 浓度的脲扩散出凝胶，并使经聚焦的胶条为第二向浓缩胶缓冲液 所平衡，有利于蛋白质从第一向向第二向的转移。 双向凝胶电泳的工作范围 蛋白质组表达模式的研究方法 样 品 分 离——双向凝胶电泳 缺陷性：极酸极碱性蛋白质、疏水性蛋 白质、极大蛋白质、极小蛋白质以及低 丰度蛋白质用此技术难以有效分离。 此技术路线采用的胶内酶解过程费时、 费力，难以与质谱联用实现自动化。 蛋白质组表达模式的研究方法 样品分离 为弥补双向凝胶电泳技术的缺陷，促进蛋白质组学研究， 目前发展了许多新型高分辨率、高通量、高峰容量的分离 分析的非凝胶技术，如液相色谱法、毛细管电泳技术等； 这些技术简化了蛋白质组研究步骤，又可与质谱联用实现 自动化，是2DE技术路线的有效补充。 凝 胶 染 色 方 法： CBB R250:考染灵敏度为30-100ng，线性范围是10-30倍 胶体考马斯亮蓝染色技术可实现PAGE的无背景染色，其极限 灵敏度为8-10ng 银染的灵敏度是ng级，线性范围是10倍；银染的缺点是：对某些 种类的蛋白质染色效果差，对其后的蛋白质测序和质谱分析造成 影响 负染：常用KCl，CuCl2和ZnCl2三种。其中ZnCl2-Imidazole灵敏 度最高，10-20ng。线性范围是10倍 荧光染料：尼罗红(Nile Red), Sypro Orange/Red/Tangerine/Ruby Sypro Ruby:灵敏度是ng级，线性范围是1000倍以上 Deep Purple: 比Sypro Ruby灵敏8倍，无染色颗粒，信噪比高 ，和质谱及测序兼容…… 蛋白质考马斯亮蓝染色方法一 染色液：0.1%考马斯亮蓝R250，25%甲醇，10%冰 乙酸 脱色液： 25%甲醇，10%冰乙酸 染色3-4小时或过夜，然后换脱色液脱色至背景清晰为 止。 蛋白质银染色方法一 步骤 溶液试剂 处理时间 固定 乙醇、冰乙酸 30min 敏化 乙醇、戊二醛、乙酸钠 30min 漂洗 双蒸水 5min×3次 银反应 硝酸银、甲醛 20min 漂洗 双蒸水 1min×2次 显影 碳酸钠、甲醛 2-5min 终止 EDTA-NA-2H2O 10min 漂洗 双蒸水 5min×3次 保存 甘油 20min 保存 甘油、乙醇 30min×2次 扫 描： 用于考染、银 染凝胶扫描 用于荧光染凝 胶扫描 ImageMaster 2D 软件 用于考染、银染凝 胶图像差异分析 用于荧光标 记凝胶图像 差异分析 Decyder 软件 普通双向电泳面临的挑战 难以呈现高分子量和小分子量的蛋白 难以呈现疏水性蛋白 难以呈现极酸性和极碱性蛋白 难以呈现低丰度蛋白 胶间差异：蛋白点位置，丰度等 想寻找真正的差异？ 解决方案是之一－ DIGE －荧光差异蛋白质表达分析系统 2D-DIGE的概念 2-Dimentional fluorescence DIfference Gel Electrophoresis 能否针对普通双向电泳的缺陷加以解决？ 难以呈现高分子量和小分子量的蛋白 难以呈现疏水性蛋白 难以呈现极酸性和极碱性蛋白 难以呈现低丰度蛋白 胶间差异：蛋白点位置，丰度等 √ √√ √ 2D-DIGE概述: 在2D电泳前用荧光染料标记蛋白样品 引入内标 在同一块胶上可同时分离多至三种不同的蛋白 样品 样品需要量少 CyDye DIGE 染料的特点： 大小和电荷匹配 pH不敏感（pH8.0-9.0，8.5最佳） 光谱不重叠 灵敏度高（可以检测低至125pg的转铁蛋 白） 光稳定性好 CyDyeTM DIGE 最小比例标记荧光标记物 3 种荧光标记染料：Cy2, Cy3, Cy5 标记赖氨酸的 ε-amino 基团 携带 +1 电荷 ~3% 的赖氨酸被标记 分子量匹配 (~450Da) 经过不同荧光标记染料标记的 同一蛋白分子量改变是一致的 检测灵敏度 = 125 pg 蛋白 EttanTM DIGE minimal dye workflow Step 1 Extract Proteins Check pH Sonicatein Pellet and extract Adjust if Quantify lysis buffer supernatant necessary Require 5-10 mg/ml Step 2 Label proteins Add dye to protein Reconstitute 400 pmol dye 30 min, 4 C Quench 15 min, 4 C the dyes per 50 g protein in the dark with lysine in the dark 用Typhoon 扫描仪得到的三色图像 Cy2 Internal Standard Cy™3 control sample Three color overlay inverted colors Cy5 treated sample 图像分析 DeCyderTM 2D software 2-D DIGE – 内标 什么是内标? 内标：即内部参照，是将实验中的每种样品等量 混合而成，并且上样至每一块凝胶中用做参照。 C1 C2 C3 T4 T5 T6 Pooled sample (internal standard) 内标的意义: Every protein in the population should appear on each gel Simplifies gel to gel matching Enables fully automated, accurate spot statistics Each sample is compared internally to the same standard Decreased gel to gel variation Able to address experimental and biological variation 2-D DIGE 与经典的二维凝胶电泳在方法学上的区别 步骤 2-D DIGE 经典的二维电泳 样品制备 标记之前不加两性电解质载体和 还原剂 浓缩蛋白至1-10mg/ml 包括两性电解质和还原剂 需要添加CyDye 用添加赖氨酸来终止标记反应 不需要添加CyDye 不需要添加赖氨酸 标记 对样品的浓缩是一个可选 择的步骤 2×样品缓冲液（ 需要 在标记后加入到样 品中） 不需要 电泳 用标准的普通玻璃板 用低荧光玻璃板 经典的二维电泳主要存在两类误差 系统误差：电泳条件不同（凝胶不同、操 作者不同）或者图象分析软件使用不当而 造成 在每块凝胶内引入内标可消除这种误差！ 固有的生物学误差：不同个体、细胞培养 等所导致 在实验设计中引入生物学重复！ 2-D DIGE 实验方案设计基本原则 将实验样品等量混合成内标 随机化原则 同类样本不出现在同一块胶上 生物学重复 实验设计的三种情况 两类样本的比较，例如对照组和处理组 多类样本的比较 多种条件的比较 1. 两类样本比较 Proteome Analysis of Brain from non –cancer and cancer tissue GE Healthcare Dr. Stacey M. Loyland Dr. G. Reid Asbury Thomas Jefferson University; Kimmel Cancer Center Dr. M. Alex Shaw 实验设计 6个冻干组织样本包含三个正常组织样本和三个病理组织样 本纳入研究。 样本用DIGE技术分析，制作制备胶用于挖点和质谱分析 Cy2 Cy3 Cy5 Gel 1 Int Std Cancer Normal Gel 2 Int Std Normal Cancer Gel 3 Int Std Cancer Normal 内标=cancer+normal 2、多重样本的比较 Four tissue samples were studied： universal control, smoke exposed, smoke exposed + two inhibitor treatments, In1 and In2 Internal Standard = UC + Smoke + SM+In1 + SM+In2 实验设计 Gel 1 2 3 4 5 6 7 8 Cy2 IS IS IS IS IS IS IS IS Cy3 UC SmInh1 Smoke SmInh2 UC SmInh1 Smoke SmInh2 Cy5 Smoke SmInh2 SmInh1 UC SmInh1 Smoke SmInh2 UC 3. 多重条件对比 Eg. Strain A vs. Strain B Time 1 vs. Time 2 vs. Time 3 vs. Time 4 Condition 1: strain Condition 2: time This experiment allows the use of 2 -way anova 实验设计： Gel 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Cy2 Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Int Std Cy3 A1 A3 B1 A4 B4 A3 B3 A1 B4 B2 A2 A4 Cy5 B2 B4 A2 A1 B1 B2 A4 A2 B3 A3 B1 B3 总 结 DIGE最大可能地消除偏差 多重样本分析 利用等量混合样本形成内标 DIGE简化了工作流程 减少运行凝胶数量 支持自动样本处理 2D DIGE 系统可以 鉴定生物学差异 精确定量, 获取具有统计学意义的蛋白质差异 DeCyder 2D能分析复杂的实验组和实验数据 注意事项及存在的问题 2D-DIGE实验中的一个问题是胶点的蛋白质离开荧光成像扫描仪后便不 可见，这对于把蛋白质点从胶上取下来再分析带来不便。 同一蛋白质未被标记的分子与被标记的分子在凝胶上的位置略有区别， 特别对于低分子质量蛋白质。 事先将图像按与凝胶大小1:1的比例打印出图谱，然后将图像与凝 胶叠合来确定蛋白质点的位置，但不能解决蛋白质“漂移”的问 题。 同时做一块2D胶，用考马斯亮蓝染色，从考染胶上找到需要的蛋 白质点切下做分析鉴定。 表达有变化的蛋白质点图谱 感兴趣蛋白质点的酶解： 从2D胶上挖取感 兴趣的蛋白质点 脱色（乙腈） 还原（DTT) 烷基化(碘 乙酰胺） 胰蛋白酶 肽段 蛋白质组研究中的样品分析鉴定 费时、费力、 不易实现高 通量分析 蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 高效、快速 日益受到人们 的重视 质谱法 质谱法概论 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质核比（ m/z)的差异来分离并确定样品的分子量。 质谱仪一般由进样器、离子化源、质量分析器、离子 检测器、控制电脑及数据分析系统组成，其中离子化 源和质量分析器是两个关键的部件。 什么是质谱仪？ 样品 离子源 + + + 质量分析器 生物质谱的种类（一） 离子源： ElectroSpray Ionization (ESI) Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization (MALDI) 质量分析器： Time of Flight (TOF) Ion Trap (IT) Quadrupoles (Q) Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance (FT-ICR or FTMS) 生物质谱的种类（二） Ionization MALDI ESI + Mass Analyzers Configurations TOF Ion Trap (IT) Quadrupoles (Q) FTMS MALDI-TOF; MALDI-TOF/TOF ESI-TOF ESI-Qq-TOF ESI-Ion Trap ESI (or MALDI or ….) FTMS ESI (or MALDI or ….) Q-q FTMS ESI-triple Quadrupoles ……… Many other hybrid configurations MALDI-TOF的基本原理 Laser Sample Target Time-of-Flight Clock Detector Molecular Mass 基质是如何帮助样品分子电离的？ 基质吸收激光后增加能量，並将部分能量传递给样品。在真空状态 下，样品雾化并接受基质的质子形成气态离子，在高压电场的作用下， 离开离子源飞向飞行管。 337 nm Laser Matrix - HCCA Time of Flight Matrix H 样品分子 离子从电场接受的动能 Ek1 =Ek2 =QU ,带同样电荷的离子 具有同样的动能; 而Ek = 1/2mV2, 离子质量数愈大，在 飞行管中飞行的愈慢. 假设 m>m1>m2 Enabling Life Science Tools Based on Mass Spectrometry TM Vacuum lock MALDI-TOF-MS 线性模式检测 Vacuum system Sample Analyte Acceleration plate molecules grids in matrix Drift tube Mass spectrum Ion detector 反射模式检测 Ion reflector +++++++ MALDI 源 Ion detector +++++++ Flight Path Increasing and Reflector Cause High Resolution 高质量准确度的图谱 肽质量指纹图 (PMF) Intens. [a.u.] TOF/TOF 二级质谱图 Angiotensin II at 1046 931.513 6000 5000 1046.555 756.390 4000 3000 354.201 400.216 110.064 2000 517.260 647.358 263.147 1000 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 m/z 搜库软件 BioTools 3.0 Detlev Suckau, Ulrike SchweigerHufnagel, Jacek Skarbek, Lars Vorwerg and Rainer Paape 设置搜库参数 Method Definition Extended all included in Method Definition now 搜库结果（已成功鉴定到该蛋白质）： 实体肿瘤的蛋白质组学研究 肿瘤是一种常见病和多发病，人体的各个器官、各种组织都可以 发生肿瘤。 少数肿瘤（如白血病、腹水瘤等）呈悬浮细胞生长，但大多数肿 瘤都以形成组织肿块为特点，即所谓的实体瘤。 蛋白质组学研究能动态、整体、定量地考察疾病发生发展过程中， 蛋白质种类、数量的改变，有助于研究者们寻找到疾病诊断和预 后的特异性标志物以及药物治疗的靶标。 肿瘤蛋白质组学是用蛋白质组学技术研究肿瘤发生发展的过程和 规律，其产生是蛋白质组学与肿瘤学交叉渗透的结果。 实体肿瘤的蛋白质组学研究 当前，肿瘤蛋白质组学研究常见的思路是：鉴定和定量分析某一 特定组织内肿瘤细胞与其正常起源细胞之间或肿瘤细胞在药物处 理前后差异表达的蛋白质。 并以此作为肿瘤早期检测和治疗的生物标志物，同时建立相应肿 瘤组织或细胞的蛋白质数据库。 采用的方法主要还是双向凝胶电泳、质谱和生物信息学分析等。 肿瘤蛋白质组学研究的常见思路 对照 肿瘤 分析性2-DE 分析性2-DE 通过视觉和图像分析软件进行比较 蛋白质点的增加、缺失和强度变异 胶内消化 印迹 肽混合物 转膜 质谱鉴定 免疫染色 蛋白质的鉴定及功能分析 寡核苷酸合成 蛋白质试验 免疫组织化学 基因 蛋白质活性 蛋白质定位 多肽合成 抗体制备 实体肿瘤蛋白质组学研究现状 除白血病等少数肿瘤之外，绝大多数肿瘤都属于实体 瘤。 现有的肿瘤蛋白质组学研究资料以实体瘤为主，尤其 是来源于上皮组织的癌的蛋白质组学研究占90%以上。 目前国内外已对鼻咽癌、肺癌、乳腺癌、卵巢癌、肝 癌、结直肠癌、肾癌、膀胱癌、前列腺癌和伯基特淋 巴瘤等多种肿瘤进行了蛋白质组研究，并获得了具有 重要意义的结果。 鼻咽癌： 1.陈爱兰等分析了 42例鼻咽癌组织以 及鼻咽正常黏膜组 织中的蛋白质，鉴 定了36个差异表达 的蛋白质 2.发现Stathmin在鼻 咽癌组织中表达明显 增高，而14-3-3σ、 Annexin A1在鼻咽癌 组织中表达明显下降 3.三个差异蛋白质 可作为预测鼻咽癌 转移和预后的潜在 分子标记物 中南大学肿瘤研究所采用磷酸化蛋白质 组学技术分析EBV潜伏膜蛋白1（LMP1） 的信号通路，发现在鼻咽癌细胞株CNE1 中Stathmin和Annexin A1等蛋白质是 LMP1的信号靶分子。 肺癌： Oh等建立了肺癌蛋白质表达数据库（http://wwwlecb.ncifcrf.gov/2dwgDB)，收录了不同类型、不同 分期肺癌所表达的大量蛋白质。 Takashi等利用2-DE和质谱技术分析了14例不同组 织学类型肺癌组织的蛋白质表达谱，发现不同类型 的肺癌之间蛋白质表达谱不一样，β-微管蛋白、热 休克蛋白90、核纤层蛋白B和增殖细胞核抗原等在 小细胞肺癌组织中高表达。 肝癌 Lim SO等对6位肝细胞癌患者自身的正常肝组织、肝 硬化组织和肝癌组织的蛋白质表达谱进行分析，发 现21种蛋白在6名患者中都有相同的表达变化模式， 其中肌氨酸脱氢酶、肝羧酸酯酶肽基-脯氨酸异构酶 A和核纤层蛋白B1在肝癌组织中的表达变化显著，有 可能是新的肝细胞癌的候选标志物； 而核纤层蛋白B1在肝硬化和肝癌组织中的表达逐渐 上升，可作为肝硬化的候选标志物。 胃癌： Ha GH等建立了正常人胃组织蛋白的2-DE图谱，并用MALDO-TOF MS鉴定了其中的部分蛋白，包括胞质蛋白、线粒体蛋白、核蛋白、 内质网蛋白和溶酶体蛋白。 Ryu JW等比较胃癌与配对正常胃粘膜组织的蛋白质组差异，与正 常组织相比，在胃癌中表达上调的蛋白质有NSP3、Transgelin、 Prohibitin、热休克蛋白27及其变异体、二硫化物异构酶A3蛋白、 葡萄糖相关蛋白等；表达下调的蛋白有载脂蛋白A-1,P20,二磷酸 核苷异构酶A，α1-抗胰蛋白酶、结合蛋白和血清转铁蛋白。 综上， 国内外肿瘤蛋白质组学研究正在蓬勃发展，并取 得了许多鼓舞人心的成果。 这些研究成果将寻找肿瘤标志物、肿瘤治疗和药 物作用靶分子提供重要、直接线索。 蛋白质组学将在人类治疗肿瘤的事业中发挥出越 来越重要的作用，将为揭示肿瘤发病机制、肿瘤 诊治和新药开发提供重要的理论基础。 血液肽组学 血液肽组学的研究始于2002年。 血液肽组：指血液中的低分子量蛋白片 段和肽，其分子量通常小于50kDa。 越来越多的证据表明，血液肽组中包含 了大量的未知的疾病特异性的诊断信息。 血液肽组学 这些特异性的诊断信息包括： 前体蛋白的信息 肽片段的信息（包括分子量、裂解位置、翻译后修饰 等） 肽的数量 肽所黏附的运载蛋白 血液特异低分子量肽组的来源 在肿瘤组织，由于细胞的异常生长、侵袭以及免疫系统的改变导致了蛋 白酶和蛋白水解过程的变化，从而产生肿瘤特异的肽片段或者导致正常 血液肽组量的变化。 在肿瘤组织微环境中，全长的蛋白质分子量过大，难以穿过内皮细胞屏 障进入血液循环，而蛋白裂解产生的片段很容易通过弥散作用和对流作 用自由进入血液循环。 肿瘤组织由于新生血管和静水压升高，导致更多的分子进入血液循环。 细胞的死亡、凋亡和坏死都会产生不同种类的细胞降解成分。 因此，血液肽组包含了肿瘤组织微环境中所发生的分子级联反应产生的 实时信息。 肽组生物标志物的联合应用足以反映肿瘤组织微环境在蛋白酶水平所发 生的特异反应，能够达到肿瘤早期诊断的特异性和灵敏性。 血液肽组的分类 低丰度的组织来源的肽段或前体蛋白的降解片 段 凝血反应及补体激活过程中所产生因子的一些 降解产物的额外信号 血液循环中存在的同一蛋白的不同亚型 生物标志物不单单指标记物本身，也包括它 的大小、裂解位点、翻译后修饰的丰富信息 血液肽组与肿瘤标志物 有研究者对早期卵巢癌和正常人群进行分析，获 得了一组特异性的差异低分子量肽表达模式，验 证结果表明具有100%的灵敏度和95%的特异性， 与常规使用的CA125相比取得更好的分辨结果。 在前列腺癌、甲状腺癌、口腔癌等一系列肿瘤中 肽组标志物都获得了良好的灵敏度和特异性。 最近在卵巢癌高风险人群和早、晚期患者血液中 发现了同一蛋白不同亚型的不同改变。 利用血液肽组进行 肿瘤的预测和判断 小结 采用蛋白质组学技术研究肿瘤发生发展过程中蛋白质 种类、表达水平与修饰的改变，识别与肿瘤发生发展 相关的蛋白质，不仅可揭示肿瘤的发病机制，而且可 发现肿瘤的分子标志物和治疗靶标。 蛋白质组研究已成为肿瘤研究的热点和重点领域，被 认为是从肿瘤基础研究到临床应用的桥梁。 血清肽组学为筛选肿瘤血清标志物开辟了新的途径。