Transcript Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń w ustaleniu swoistości

Próba wyjaśnienia przyczyny niepowodzeń
w ustaleniu
swoistości autoprzeciwciał przeciwjądrowych
w surowicach ANA-dodatnich w oparciu
o analizę poszczególnych
swoistości przeciwciałowych obecnych w KKI.
Jakub Ząbek, Agnieszka Palacz, Iwona Horbacz, Joanna Pyka
Zakład Mikrobiologii i Serologii Instytutu Reumatologii
Warszawa
Autoprzeciwciała występujące w układowych
chorobach tkanki łącznej
AUTOPRZECIWCIAŁA:
• Czynniki reumatoidalne
• Przeciwciała skierowane przeciwko antygenom jądrowym
(ANA) i antygenom związanym strukturalnie lub
funkcjonalnie z nimi
• Przeciwciała przeciwko fosfolipidom
• Przeciwciała przeciwko składnikom tkanki łącznej i innych
tkanek gospodarza oraz białkom cytoszkieletu
• Przeciwciała przeciwko antygenom bakterii, wirusów oraz
pasożytów
Oznaczenie obecności oraz mian i/lub poziomów
wyżej opisanych autoprzeciwciał przeciwko
antygenom komórkowym wykonuje się zasadniczo
z czterech następujących powodów:
• obecność autoprzeciwciał może być patognomoniczna dla danej
choroby,
• miano niektórych autoprzeciwciał odzwierciedla aktywność
procesu chorobowego,
• obecność danego autoprzeciwciała koreluje z określonymi
objawami klinicznymi,
• autoprzeciwciała są inhibitorami enzymów istotnych dla
funkcjonowania komórki.
Częstość występowania oraz swoistość wybranych
autoprzeciwciał “markerowych”
w układowych chorobach tkanki łącznej*
Jednostka chorobowa
SLE
Częstość występowania
/w danym schorzeniu
Swoistość /dla danego
schorzenia/
dodatnie ANA
95%
niska
anty-dsDNA
70%
>90%
anty-Sm
15%
>95%
anty-rybosomalne
białko P
10%
>95%
anty-PCNA
3%
>95%
anty-histonowe
70%
niska
anty-U1 RNP
30%
niska
anty-SSA /Ro/
30%
niska
anty-SSB /La/
20%
niska
anty-NuHi
60%
wysoka
Autoprzeciwciało
Toczeń polekowy
MCTD
Zespół Sjögrena
Skleroderma
Zespół nakładania
zapalenia wielo/skórno-mięśniowego
dodatnie ANA
>90%
niska
anty-histonowe
80%
umiarkowana
MPO-ANCA
80%
umiarkowana
dodatnie ANA
>95%
niska
anty-U1 RNP
>90%
>95%
dodatnie ANA
80%
niska
anty-SSA /Ro/
80%
umiarkowana
anty-SSB /La/
70%
umiarkowana
IgA RF
70%
umiarkowana
IgM RF
70%
niska
anty-α-Fodryna
60%
wysoka
dodatnie ANA
90%
niska
anty-centromerowe
40%
>90%
anty-Scl-70
15%
>90%
anty-jąderkowe
15%
>85%
dodatnie ANA
40%
niska
dodatnia cytoplazma
20%
umiarkowana
anty-Jo-I
25%
wysoka
anty-U1 RNP
40%
niska
Zespół
antyfosfolipidowy
anty-kardiolipinowe
100%
umiarkowana
Rzs
dodatnie ANA
50%
niska
IgM RF
75%
niska
IgA RF
70%
umiarkowana
anty-CCP
40-60%
wysoka
GS-ANA
50%
umiarkowana
anty-histonowe
40%
niska
dodatnie ANA
70%
umiarkowana
anty-histonowe
60%
umiarkowana
IgM RF
15 – 30%
umiarkowana
GS-ANA
15%
umiarkowana
anty-CCP
~ 30%
wysoka
MIZS
*Dane pochodzą z opracowania Statens Seruminstitut /Kopenhaga, Dania/ zalecanego przez European
Consensus Finding Study i mogą nieznacznie różnić się od danych w tekście /pochodzących z konkretnych
cytowanych prac/
Przeciwciała wykrywane w układowych chorobach
tkanki łącznej
! Metody immunofluorescencyjne
Metody immunoprecypitacyjne
Odczyny immunoaglutynacyjne
● Metody immunoenzymatyczne
● Metody nefelometryczne
Przyczyny niepowodzeń
1. Typ testu (czułość testu)
2. Skład antygenowy testu
3. Antygeny rekombinantowe
4. Natura antygenu /podfrakcje/
5. Wieloswoistość surowic
6. Normy
7. Kompleksy immunologiczne
–––––––––––––––––
8. Wiek pacjenta
Porównanie częstości identyfikacji określonej swoistości ANA
w grupie 76 surowic uzyskanych od pacjentów
z układowymi chorobami tkanki łącznej
Częstość /%/ identyfikacji swoistości
100
80
60
40
20
0
1/80
ANA (-)
1/80
ANA (+)
1/160
ANA (+)
1/320 i >
ANA (+)
Kaskadowa metoda oznaczania swoistości przeciwciał ANA
Kompleksemia występująca w surowicach pacjentów
z układowymi chorobami tkanki łącznej jest zwykle skojarzona
z fazami zaostrzenia procesu podstawowego, jak ma miejsce w TRU,
gdzie towarzyszy hipokomplementemii, podwyższeniu wskaźników
ostrej fazy i wskaźników aktywności choroby oraz zmianom
poziomów i awidności autoprzeciwciał.
Mało uwagi poświęca się temu, że procesowi zaostrzenia
choroby zwykle towarzyszyć mogą dwa zjawiska, pierwsze to
wyrzut z zajętych narządów/tkanek do krążenia autoantygenów,
drugie to związanie autoprzeciwciał krążących w KKI.
Pierwszy fenomen jest niedocenianym na ogół wskaźnikiem
aktywnego procesu destrukcji narządów/tkanek, a drugi prowadzi do
neutralizacji krążących autoprzeciwciał i obniżenia ich mian
w surowicach.
Celem pracy była analiza KKI pod kątem
ewentualnej obecności autoprzeciwciał markerowych
trudnych diagnostycznie surowicach ANA-dodatnich,
w
których
klasycznymi
metodami
stosowanymi
w serodiagnostyce autoprzeciwciał nie udało się ustalić
swoistości przeciwciał ANA.
Materiał i metody
Badania przeprowadzono na grupie 588 surowic
skierowanych do Zakładu Mikrobiologii i Serologii IR
w celu oznaczenia miana i typu ANA oraz ustalenia
swoistości
ANA.
i Polikliniki IR.
Surowice
pochodziły
z
klinik
Materiał i metody
W surowicach oznaczano następujące parametry:
·miano i typ świecenia ANA metodą IIF na slajdach z utrwalonymi komórkami Hep-2
(firmy Euroimmun, Niemcy) oraz metodą „Colorzyme” (firmy Immunovision, USA),
·poziomy autoprzeciwciał (w zależności od typu świecenia ANA metodami ELISA
i Western-blotting na teście ANA-ENA RecomLine firmy Biomedica-Poland
Sp. z o.o.),
·poziom KKI metodą immunoenzymatyczną (C1q – CIC kit) firmy Quidel (USA),
·frakcję wzbogaconą w KKI uzyskiwano metodą wytrącania glikolem polietylowym
o ciężarze cząsteczkowym 6000 (PEG-6000) wg Świerczyńskiej i wsp.
·frakcję γ z osadów PEG-6000 uzyskiwano przez wytrącanie nasyconego siarczanu
amonu w pH 3,5 (stosowanym do dysocjacji KKI) wg metody własnej,
·białko we frakcji γ i osadach PEG-6000 oznaczano spektrofotometrycznie metodą wg
Kalckara.
Wyniki
Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-)
5-15% (11,7%)
n=69
n=588
Wyniki
Odsetek surowic ANA+ / autoprzeciwiała (-), gdzie
w osadach PEG znaleziono autoprzeciwciała
16%
n=69
84%
Porównanie typów „świecenia” w met.IIF z surowic(1a,2a) i osadów PEG(1b,2b)
Przykłady swoistości autoprzeciwciał znalezionych
w surowicach i osadach PEG metodą Western-blott
Struktura KKI
Wybrany przykład neutralizacji surowicami
anty-Fc i Fab swoistości przeciwciał
występujących w osadach PEG
A
B
C
A - pasek inkubowany z osadem PEG-6000
B - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą antyF(ab2)
C - pasek inkubowany z osadem PEG-6000 traktowanym surowicą anty-Fc
Szczegółowa analiza składu KKI na podstawie neutralizacji
swoistości surowicami anty-Fc i anty-(Fab2)
Swoistości oznaczane metodą Western blotting w wybranych surowicach oraz
w osadach PEG
Surowica
Lp.
pacjent
osady PEG-6000
ANA
miano
typ
świecenia
typowanie
swoistości
Kontrola*
+sur.
antyFab*
antyRo ślad
antyHp ++
antyDNA
słaby+
antyRo +
antyHp++
antyDNA+
+sur.antyFc*
1
KS
1/5120
plamisty
anty Hp-ślad
antyRo+
antyHp++
antyDNA+
2
JZ
1/640
plamisty
antyRo +/antyHp ślad
antyRo-60 +/antyRo-52 +
+/+/-
Ślad
+
3
WK
1/640
homogennoplamisty
antyHp +/-
antyRo+
antyHp+
antyDNA+
ślad
-
ślad
ślad
4
GO
1/1280
plamisty
antyHp +/-
antyHp+
antyDNA+/-
+
-
+
+/-
5
FO
1/320
homogennoplamisty
antySmB +/-
antySmB++
antySmD ślad
++
ślad
++
ślad
6
RL
1/320
homogennoplamisty
(-)
antyHp słaby +
antyDNA słaby +
+
słaby+
++
+
7
PK
1/640
plamisty
antyRo ślad
antyRo+/antyHp+++
antyDNA+
ślad
+
ślad
+
++
słaby+
Autorzy chcą także ustalić, czy pojawienie się
aktywności
przeciwciałowej
po
precypitacji
glikolem
polietylenowym o masie cząsteczkowej 6000 Daltonów jest
efektem prostego zgęszczenia frakcji KKI po wytrąceniu
glikolem czy też mamy do czynienia ze zmianą konformacji
poszczególnych
–
będzie
białek
to
wchodzących
przedmiotem
w Zakładzie Mikrobiologii i Serologii.
w
skład
dalszych
KKI
badań
Autorzy w przedstawionej pracy zaproponowali nowe metodyczne
podejście do analizy surowic ANA-pozytywnych, w których nie udaje się
standardowymi metodami ustalić swoistości autoprzeciwciał.
Zaproponowana metoda polega na analizie swoistości autoprzeciwciał
nie w surowicy pełnej, ale w osadach po PEG-6000 (czy ewentualnie frakcjach γ
z tego osadu), który zawiera obok innych makroglobulin surowiczych, także
zgęszczoną frakcję KKI.
Stosując tę metodę udało się ustalić swoistość przeciwciał
występujących w KKI w 84% surowic ANA(+), w których metodą standardową
nie udaje się tego dokonać.
Autorzy mają nadzieję, że opracowane przez nich podejście, po
niezbędnych dla celów rutynowej diagnostyki przeciwciał uproszczeniach,
znajdzie zastosowanie w serodiagnostyce autoprzeciwciał markerowych, i to nie
tylko w układowych chorobach tkanki łącznej.
Dziękuję za uwagę