Transcript 18,都市部花粉アレルゲン特性調査プロジェクト

NO. 18 都市部花粉アレルゲン特性調査プロジェクト
プロジェクト参加者: 森田
指導教員:
王
淳（M1）呉 迪（M2）
青躍
学外連携組織：
国立環境研究所、廃棄物処理企業、埼玉県環境科学国際センター
Abstract
In Japan, Japanese cedar (Cryptometria japonica) and cypress (Chamaecyparis obtusa) pollens are considered to be the major unique allergens which can
give rise to severe pollinosis and their extent of dispersal is quite wide, especially in the urban area. Cry j 1 is a causative substance of Japanese cedar pollinosis, and it may deteriorate
by Cry j 1 invasion to a lower respiratory tract. We observed airborne particles containing Cry j 1 by an immunofluorescence technique using a fluorescence microscope. We evaluated a
Cry j 1 reacted with various air pollutants by liquid phase reaction. My study will pay attention to pollen morphological observation, allergenic measurement of airborne pollens and crossantigenicity evaluation in Japanese urban areas, also including the investigation of various pollens in Chinese urban areas. Morphological changes of pollens will be observed by an
optical microscope, a fluorescence microscope and a scanning electron microscope to confirm the existing evidences of visualized suspended particulate matter containing the Japanese
cedar and cypress pollen allergens.
【Cry j 1の移流と変性可能性】
①スギ花粉飛散期、山間部からスギ花粉粒子が飛散
②Cry j 1を含むユービッシュ小体の剥離
③都市部の大気汚染物質によるユービッシュ小体中Cry j の変性可能性
変性したCry j 1が
呼吸により気道内へ侵入
都市部におけるスギ花粉
症の有病率が増加??
Cry j 1タンパク質はアミノ酸であるチロシン残基を16個有する
Cry j 1中のチロシン残基も同様に、NO3あるいはOHラジカルと反応し3ニトロチロシンへと変化する可能性
目 的
都市部におけるスギ花粉症有病率の増加
→3-ニトロチロシン含有Cry j 1の上気道・下気道への侵入
本研究では
3-ニトロチロシン含有Cry j 1の定量法の開発
3-ニトロチロシン含有Cry j 1の細胞に対する
毒性の評価
実験方法
Ⅱ、スギ・ヒノキ花粉アレルゲン共通性
飛散期はスギ花粉が2月－4月、ヒノキ
は3月中旬－5月といわれている。スギ花
粉は最も重要な花粉症の原因で社会問
題ともなっている。感作、発症も低年齢
化しているといわれ、幼児のスギ花粉症
例も報告されている。スギ花粉が飛散し
終わった直後の4月に、ヒノキ花粉が飛
散する。スギ花粉飛散終了後のヒノキ花
粉飛散時期でも症状が持続すると報告さ
れている。スギ花粉とヒノキ花粉は構造
が非常に似ているので、スギ花粉症の
80％以上の人間がヒノキ花粉症にもなっ
ていると言われている。
【大気サンプリング】
サンプリング期間 : 2010年3月14日～16日 地点 : 埼玉大学廃液処理センター
サンプリング装置 : アンダーセンハイボリウムエアサンプラー (AHV)
流量 : 566 L/min
捕集時間 : 71時間
使用したフィルター : 1段目 (> 7.0 m)、2段目 (3.3 ~ 7.0 m)、5段目 (< 1.1 m)
植物名
実験方法
ヒノキ
イチョウ
スギ
Abs (Sample) – Abs (Blank)
0.12
すべての粒径範囲のタンパク質溶液
において、3-ニトロチロシンが検出
0.1
0.08
3-ニトロチロシン残基を含む
タンパク質が大気中に存在
0.06
0.04
0.02
0
7.0mm
m
>> 7.0
3.3 mm
m ～
~ 7.0
3.3
7.0m
mm
< 1.1
1.1 mm
m
Fig. 2. The result of One-Side ELISA method (n = 3).
大気中においてCry j 1は粒径1.1 m以下の粒子範囲に存在
5段目 (< 1.1 m) のタンパク質含有溶液中に3-ニトロチロシンが検出
大気中における3-ニトロチロシン含有Cry j 1の存在が示唆
ヒノキ
表面プラズモン共鳴法（SPR）
【大気サンプリング】
サンプリング期間 : 2010年4月12日～26日 地点 : 埼玉大学廃液処理センター
サンプリング装置 : アンダーセンハイボリウムエアサンプラー (AHV)
流量 : 566 L/min
捕集時間 : 一週間
結合
解離
baseline
Time
結合データ
解離データ
抗Cry j 1抗体をセンサーチップの金薄膜表面に固定化させておいて、サンプルをセンサーチッ
プに流したときにサンプル中のCry j 1と結合反応すれば、チップ表面上の質量が増加し、これ
を表面プラズモン共鳴の変化として捉えれば抗体と結合したCry j 1濃度が定量できる。
結 果
Cry j 1 concentration (ng/m3)
片側ELISA法によるタンパク質中の3-ニトロチロシンの検出
5月 6月
スギ花粉とヒノキ花粉は、花粉に含まれるタンパク質のうちのアレルギーの原因となる
物質（抗原）においてＩｇＥ抗体の産生に関して共通の作用があり、これを共通抗原性と
いう。実際にスギ花粉症患者さんの約8割がヒノキ花粉に対するＩｇＥ 抗体を持ってい
ることが報告されている。本研究では、スギ花粉・ヒノキ花粉飛散期において、大気サ
ンプリングを行い、スギ花粉とヒノキ花粉の花粉形態観察し、実際に大気中に飛散し
ているスギ花粉・ヒノキ花粉および花粉アレルゲンを粒径別に捕集し、花粉間の抗原
共通性の評価を行うことを目的する。
>7.0 m
3.3-7.0 m
2.0-3.3m
1.1-2.0m
<1.1 m
3
Monoclonal antibody cry j 1
スギ花粉モノクロ抗体を用いて
測定した結果
2
1
0
4/12-4/18
Cry j 1 concentration (ng/m3)
結 果
2月 3月 4月
スギ
【片側ELISA法の実験手順】
①、AHV大気捕集フィルターから抽出したタンパク質含有溶液をウェル
に100 L添加し、37℃で2時間インキュベートした。
⑥
②ウェル内の溶液を除去した後、BSA/PBSをウェルに100 L添加し、
⑤
37℃で2時間インキュベートした。(ブロッキング)
③ウェル内の溶液を除去し、Tween 20含有PBS (TPBS)とPBSによる
④
ウェルの洗浄の後、3-ニトロチロシン抗体 (PBSで1 : 100に希釈) を
ウェルに100 L添加し、37℃で2時間インキュベートした。
④ウェル内の溶液を除去し、TPBSとPBSによるウェルの洗浄の後、
③
ホースラディッシュペルオキシダーゼ標識IgG抗体 (PBSで1 : 5000に希
釈)をウェルに100 L添加し、37℃で1時間インキュベートした。
⑤ウェル内の溶液を除去し、TPBSとPBSによるウェルの洗浄の後、発
①
色基質であるo-フェニレンジアミンをウェルに100 L添加し、室温で30
②
分間静置した。
⑥発色を停止させるため1 M H2SO4をウェルに100 L添加し、プレー
Fig. 1. Principle of One
トリーダー (測定波長492 nm, 対照波長630 nm)にて吸光度を測定した。 Side ELISA Method.
1月
目 的
を目的とする。
片側ELISA法
関東地域主要花粉カレンダー
Response (RU)
Ⅰ、スギ花粉アレルゲンの変性
>7.0 m
3
3.3-7.0 m
4/20-4/26
2.0-3.3m
1.1-2.0m
<1.1 m
Polyclonal antibody
ポリ抗体で同じサンプルを測定
した結果とモノクロ抗体で測定し
た結果の比較すると、スギ花粉
以外の花粉アレルゲンを存在す
ることが分かった。
2
1
0
4/12-4/18
4/20-4/26
花粉形態観察によってこの時期スギ花粉とヒノキ花粉を存在すること
大気中におけるスギ花粉とヒノキ花粉アレルゲンの共通性が示唆