Transcript Tests de dépistage, intérêts, mise en œuvre, interprétations

Tests de dépistage, intérêts,
mise en œuvre, interprétations
Olivier MATHIEU PharmD, PhD
Expert inscrit près la CA de Montpellier
Maître de Conférences des Universités – Praticien Hospitalier
Département de Pharmacologie Médicale et Toxicologie
Université Montpellier 1, CHRU de Montpellier
24 mai 2012
Ma vision de « biologiste HU»
• Analytique  évaluation technique
• Toxicologique  pertinence clinique
• Pharmacologique  interférences
Ma vision d’expert
• Conséquences bivalentes du résultat rendu
• Souci de la contre-expertise
• Objectivité indispensable
 Objectif : critères de choix et non des choix tous faits
Contextes des dépistages
• Clinique  équipement influencé par le coût/activité
• Médico-légal  gendarme / expertise
• Médecine du travail  « biologique et non biologique »
– Non biologique # salivaire
– Biologique # urine et sang  acte médical et/ou de biologie
Environnement de réalisation des
dépistages
• Laboratoire de biologie  utilisateur confirmé
– Norme ISO 15189
• Bord de route  utilisateur technique
– Agrément ministériel
• Cabinet médical / local de consultation  utilisateur ?
 norme de la biologie délocalisée ISO 22870:2006 ? NON…
Exigences analytiques
• Sensibilité/faux négatif et spécificité/faux positif
• Seuil réglementaire décisionnel
• Besoin d’une technique de confirmation quantitative
• Appareillage et technicité de l’utilisateur
• Fiabilité, robustesse (température de conservation…)
• Coût unitaire
La problématique du dépistage
Spécificité
Sensibilité
Coût
Rapidité
Concilier
Cadence
Urgence
Moyens techniques et
compétences disponibles
Coût
d’investissement
Sensibilité
Une large gamme de solutions analytiques
Spécificité
LC-MS/MS
Extraire
LC-MS
Isoler
Détecter
GC-MS
Détection in situ
parmi les
molécules
interférentes
potentielles
HPLC-DAD
Immuno-enzymologie
Cadence
Simplicité
Mise en œuvre
• Milieu facile d’accès  salive > urine
• Méthodologie robuste = simplifiée et standardisée
• Lecture « simple », qualitative  présence/absence
• Interprétation : souvent l’oubliée
Mise en œuvre
• Aspects techniques pratiques
– Bandelette urinaire, très simple, problème d’obtention
des urines du patient (adultération…)
Mise en œuvre
• Aspects techniques pratiques
– Kit salivaire, protocole plus lourd, le bon échantillon
Débris salivaires et
centrifugation
Tampons buccaux
collecteurs
Agents abaissant la
viscosité
Ex codéine :
Crachat
Stimulation
mécanique
(chewing-gum)
Agents chimiques
(acide citrique) de
salivation
Evaluation encore à poursuivre :
Verstraete et Labat, Ann Toxicol Anal 2009, 21(1) : 3-8
Verstraete et coll, Ann Toxicol Anal 2011, 23(3) : 133-138
Mise en œuvre
• Aspects techniques pratiques
– Automate
Mise en œuvre
• Aspects techniques pratiques
– Bandelette urinaire
– Kit salivaire
– Automate
= Lecture et technicité toujours simples
Oui MAIS
Des considérations théoriques pour mieux
comprendre et avoir des critères objectifs
de choix entre kits commerciaux
Principe unique partagé
Méthode immuno-enzymologique
 utilisation d’un anticorps (Ac)
 compétition avec un analogue de l’analyte (Ag)
 révélation de la liaison Ag-Ac
 limites dues à la méthode
Technique des plaquettes = immunochromatographie
Ag (cannabis…) présent (résultat positif) ou absent dans
l’échantillon
Ag* marqué avec une enzyme toujours présent dans le kit
Anticorps anti-Ag
Dépôt
Migration
Résultat NEGATIF 
Lecture
Contrôle
Dépôt
Bande contrôle
(validité du test)
Environnement de
révélation du marqueur
Dépôt
Résultat POSITIF 
Contrôle
Dépôt
Bande contrôle
(validité du test)
Environnement de
révélation du marqueur
Dépôt
Technique EMIT (automates)
 Intensité de la réponse croissante avec la concentration de l’analyte (drogue)
Absence d’analyte :
Ag* marqué
avec une enzyme
AC
Ag* AC
 Signal inhibé
Présence d’analyte :
Analyte
Aspects « quantitatifs »
Interférences : effet matrice
Question :
On veut transposer un très bon test de dépistage sanguin à un dépistage urinaire
(même anticorps)
On montre que l’effet matrice ne modifie pas la réponse du test
C’est-à-dire qu’en surchargeant du sang et de l’urine avec une même concentration
de la même molécule on obtient le même résultat
La transposition est-elle validée ?
La démonstration de l’absence d’effet matrice pour le passage
d’un test de dépistage d’une matrice à une autre n’est pas
suffisant pour juger de la pertinence toxicologique de ce test :
Il faut considérer la voie métabolique avant tout !
Interférences : faux négatifs
• Matrice explorée : aspects qualitatifs, quantitatifs et temporels
Salive = ultrafiltrat du plasma
Molécules avec liaison protéique forte et gros volume de
diffusion
 molécules présentes dans le plasma
 la sensibilité doit être élevée échelle 10 ng/ml
 la fenêtre de détection est faible (<12h)
Interférences : faux négatifs
• Matrice explorée : aspects qualitatifs, quantitatifs et temporels
Urine = concentré du plasma « polarisé »
 métabolites polaires et des conjugués
 la sensibilité est plus accessible échelle 100 ng/ml
 intérêt de la fenêtre de détection plus large (>12h)
Cascade métabolique type des benzodiazépines
Diazépam
Temazépam
Chlordiazépoxide
Nordazépam
Prazépam
Clorazépate
Oxazépam
Oxazépam essentiellement urinaire
Distinction avec une prise d’oxazépam sur l’exploration sanguine
Cascade métabolique simplifiée de l’héroïne
Héroïne
6MAM
Morphine
Codéine
Morphine-glucuroconjuguée
Sensibilité urinaire plus importante si le conjugué est détecté
Interférences : faux négatifs
• Matrice explorée : aspects qualitatifs, quantitatifs et temporels
• Seuil de sensibilité : dépend essentiellement de l’anticorps©
Sensibilité du test  seuil de positivité
Salive
Urine
Interférences : faux positifs
• Liées à la parenté structurale
– Au sein de la même classe pharmaco-chimique
 Notion de seuil dépendant de la molécule
 Notion de réponse équivalente
 Notion de pertinence clinique (pharmacologie)
Notion de seuil et de réponse équivalente
Signal = 100 % de la référence
 Seuil 300
Affinité = 1
Molécule de référence A
Affinité = 0.1 Anticorps du test de dépistage
Molécule proche B
Signal 10 % de la référence
 Seuil 3000
Profil type des réponses immuno-enzymologiques
Réponse immuno-enzymologique à différentes benzodiazépines
2,5
Alprazolam
Bromazépam
Chlordiazépoxide
Lormétazépam
Clobazam
Clonazépam
Diazépam
Estazolam
Flunitrazépam
Lorazépam
Midazolam
Nitrazépam
Nordiazépam
Oxazépam
Prazépam
Témazépam
Triazolam
Valeur mesurée (µg/ml)
2
1,5
1
0,5
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
Concentration réelle (µg/ml)
Automate Siemens, test BENZ, anticorps anti-diazépam, calibré et contrôlé avec le lormétazépam
Notion de seuil : Réponse analytique et signification clinique
pour le clonazépam
Réponse au clonazépam
0,6
Valeur mesurée (µg/ml)
0,5
0,4
0,3
seuil
0,2
0,1
Concentration plasmatique toxique
0
0
0,5
1
1,5
Concentration réelle (µg/ml)
2
2,5
Notion de seuil : Réponse analytique et signification clinique
pour le diazépam
Réponse au diazépam
0,9
0,8
Valeur mesurée (µg/ml)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Seuil
0,2
0,1
Concentration plasmatique thérapeutique
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Concentration réelle (µg/ml)
0,7
0,8
0,9
1
Notion de seuil : Réponse analytique et signification clinique
pour le nitrazépam
Réponse au nitrazépam
0,9
0,8
Valeur mesurée (µg/ml)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
Seuil
0,2
0,1
thérapeutique
toxique
0
0
0,1
0,2
0,3
Concentration réelle (µg/ml)
0,4
0,5
0,6
Interférences : faux positifs
• Liées à la parenté structurale
– Au sein de la même classe pharmaco-chimique
– Avec des molécules a priori plus éloignées
 Plus le seuil ou « cut-off » est bas, plus on
concède sur la spécificité (plus de faux positifs)
Ethanol
Méthodes enzymologiques (fonction -OH)
 Affinité de l’enzyme pour les autres alcools
 Atmosphères riches en solvants (méthanol, propanol…)
ENVIRONNEMENT DE REALISATION !!!
Amphétamines
•
•
•
•
•
Amphétamines
seuil 300 ng/ml (variable)
Heptaminol
Pseudo-éphédrine
Tuaminoheptane
MDMA
Cannabinoïdes
• Très spécifique : sauf acide niflumique
• seuil 10 ng/ml (variable)
• Problème du seuil et du métabolite inactif
– THC psychoactif
– 11-OH-THC psychoactif
– THC-COOH inactif, détecté le plus longtemps
Que faire du résultat ?
Fenêtre de détection du jour au mois !
Opiacés
• Les opiacés de la toux
• seuil 300 ng/ml (variable), conjugué ?
• Méthadone et buprénorphine à part
• Fentanyl… à part
• Designés « stupéfiants » = opiacés dont codéine
Que faire du résultat ?
 «différenciation» obligatoire
Cocaïniques
• Très spécifiques
• Fenêtre de détection : 48h
• Que faire du résultat ?
• données seuils 100 ng/ml (variable)
• BZE 100 // cocaïne 1000
Autres kits urinaires disponibles
•
•
•
•
•
•
Barbituriques
Benzodiazépines
Kétamine
Phencyclidine
TCA
Cotinine
Utilisation/évaluation des tests de dépistage
au laboratoire de toxicologie du CHRU de Montpellier
• Contexte médico-légal
- Dépistage (hors benzodiazépines)
- Confirmation par chromatographie / spectrométrie de masse
• Contexte hospitalier et médico-légal
- Base ouverte de faux positifs (prospectif)
- Accès aux faux négatifs :
+ Veille bibliographique : test des nouvelles drogues
+ Réanalyse périodique (révision seuil positivité)
Critères bibliographiques
d’évaluation d’un test
Y a-t-il un label :
– ministère intérieur et Rapid Stat salivaire 2008
Existence de données comparatives bibliographiques :
– études indépendantes
– souvent une seule classe, une matrice
– représentativité de la population exposée
– évolution des molécules consommées
Critères bibliographiques
d’évaluation d’un test
Alternative : lecture critique des performances
• Quels sont les seuils de positivité ? Sont-ils cliniquement pertinents ?
• Quelle est la matrice de développement initial de l’anticorps ?
• Les interférences endogènes ont-elles été testées ?
• Les interférences avec les médicaments usuels ont-elles été testées ?
• Dispose-t-on de la liste des interférences avec seuil (faux positifs) ?
• Les données chiffrées des seuils d’interférence sont-elles données ?
Critères bibliographiques
d’évaluation d’un test
Alternative : lecture critique des performances
• Quel est le suivi prospectif de révision du kit après la commercialisation ?
• Existe-t-il une veille analytique du fabriquant vis-à-vis des nouvelles
molécules ?
• Y a-t-il un système de contrôle de qualité : bande test / solutions tests ?
• Conservation des tests ?
• Rentabilité des tests ?
Quelques cas pratiques
• Lecture de notice
• Comparaison de kits
• Cas réels aux conséquences potentiellement
délétères en pédiatrie
Qualité de la notice d’un kit
urinaire amphétamine :
 Liste des molécules interférentes
 Nombre conséquent
 Seuil testé
Qualité de la notice d’un kit urinaire
amphétamine (suite) :
Evaluation pertinente ?
Nouvelles amphétamines ?
Excrétion urinaire nulle
Kit urinaire opiacés :
Ce kit permet-il de
différencier une prise :
de codéine,
de morphine,
d’héroïne,
d’oxycodone ?
Des interférences attendues non documentées :
Actualisation au cas par cas
Des interférences non attendues documentées
Certaine polyvalence
2 Kits urinaires :
Quelle différence ? quel choix ?
Discriminant de la D-AM
Des interférences surprenantes et potentiellement délétères :
Des interférences prévisibles potentiellement délétères :
« Il existe une proportion importante de femmes enceintes dont les urines
sont rendues positives aux amphétamines avec nos kits de dépistage »
Parce que :
- L’établissement accueille des femmes enceintes toxicodépendantes aux
amphétamines
- Certaines femmes enceintes excrètent dans les urines des composés
endogènes proches des amphétamines
- Certaines femmes enceintes sont traitées par un médicament qui positive les
kits
- Autre réponse
Alpha-méthyldopa ALDOMET
Ecstasy = MDMA
Conclusion sur les tests de dépistages
• Facilité de mise en œuvre
• Difficulté d’évaluation/d’interprétation : kit/molécule
• Mon vécu : pratique mais soulagement du recours tout
proche à la LC/MSMS
• Nombreuses questions : le patient a dit, les secours ont
trouvé…
– … et vous avez rendu positif ?
– … et vous avez rendu négatif ?