Transcript Lp - 岡山大学 資源植物科学研究所

研究室の紹介
Recent progress in aquaporin research
• 発現制御 (expression)
分子種間 (among genes)
部位/分化特異性 (tissue/development specific)
環境ストレス応答性 (stress response)
形質転換系 (transgenic)
• 活性制御 (activity)
リン酸化 (phosphorylation)
分子間相互作用 (intermolecular interaction)
細胞内輸送 (cellular trafficking)
• 個体形質との関連 (phenotype)
発現制御 Expression
(Normalize to control (0 mM NaCl))
4
HvPIP1;1
2
109
(control)
0h
0 mM/1 h
0 mM/2 h
108
1
HvPIP1:3
1/2
HvPIP1;4
HvPIP1;5
1/4
HvPIP2;1
1/8
HvPIP2;2
1/16
HvPIP2;3
0 mM/4 h
0 mM/8 h
107
0 mM/12 h
106
1h
2h
4h
8h
12 h
24 h
0 mM/24 h
HvPIP2;4
HvPIP2;5
はるな二条 100 mM NaCl
109
(100mMNaCl)
4
100 mM/4 h
100 mM/12 h
106
100 mM/24 h
(200mMNaCl)
0h
200 mM/1 h
HvPIP1;1
2
100 mM/8 h
107
108
100 mM/1 h
100 mM/2 h
108
109
0h
HvPIP1;2
Relative ratio
Amount of transcript (copies/µg total RNA)
1010
HvPIP1;2
Relative ratio
オオムギ根でのPIPアクアポリン１0種のmRNA量
1
HvPIP1:3
1/2
HvPIP1;4
HvPIP1;5
1/4
HvPIP2;1
200 mM/2 h
200 mM/4 h
107
200 mM/8 h
106
200 mM/24 h
200 mM/12 h
105
var. Haruna-nijyo (salt tolerance: middle)
5-day old seedlings
(PCP 52:663)
1/8
HvPIP2;2
1/16
HvPIP2;3
1h
2h
4h
8h
12 h
24 h
HvPIP2;4
HvPIP2;5
はるな二条 200 mM NaCl
Mild (100 mM) stress → No changes
Severe (200 mM) stress → Mostly decrease
However, in root hydraulic conductivity (Lpr) …
（根水透過性）
1
LPr [10-6 m s-1 MPa-1]
Salt tolerant var. K305
Salt sensitive var. I743
0.5
K305
I743
0
0
100
200
NaCl [mM]
(4 hr after salt stress)
Pressure chamber
Sap flow: Jv
Jv /A = Lpr (ψp - Y)
sap flow
(ml h-1 mm-2 root
surface area)
発現量の多いPIPや発現変動が大きいPIP
・・・品種間で一致する傾向
全体的に塩感受異性品種で発現が多い
(SSPN 57:50)
A : total root surface area
ψp: applied pressure
Y : Yielding pressure
0.004
0.003
0.002
0.001
0
R² = 0.9764
0
0.1
0.2
Pressure (MPa)
0.3
0.4
33種類のイネアクアポリン プロファイル （東北農研他）
PIP1;1
PIP1;2
PIP1;3
Related to
cold stress
TIP1;1
TIP1;2
Related to
the flooding
NIP1;1
(NIP1;2)
SIP1;1
SIP2;1
RiceXPro
TIP2;1
Lateral
root
NIP1;3
PIP2;1
‘house
keeping’
(CO2)
PIP2;2
TIP2;2
TIP3;1
internodes
& panicle
neck
(CO2)
(H2O2)
Putative
ABRE in
promoter
NIP1;4
NIP2;1
(Si)
(As)
(H2O2)
PIP2;3
PIP2;4
Sensitive
to water
stress
PIP2;5
‘rescue’
internodes &
panicle neck
PIP2;6
PIP2;7
(TIP3;2)
TIP4;1
TIP4;2
TIP4;3
TIP5;1
NIP2;2
(Si)
(As)
NIP3;1
(B)
NIP3;2
(As)
(H2O2)
NIP3;3
(As)
(H2O2)
NIP4;1
全ての器官に存在 (>105 copies/ μg total
PIP2;8
RNA)
鱗被, 花糸、節間成熟部位
根に特異的
節、節間成熟部位
葉に特異的
葯に特異的
登熟中の種子に特異的
どの器官でも発現していない。
http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/ における OsMIP familyの発現 → 例
シロイヌナズナPIP （資源植物科学研究所・森先生と）
シロイヌナズナ孔辺細胞で発現が多いPIPの同定
AtPIP2;2, 2;3, 2;5, 2;8
遺伝子破壊株の気孔運動解析
3.5
（ΔPIP2;3）
3
Col
#099862 (PIP2;3) 3.5
#117876 (PIP2;3-2)
#072405 (PIP2;5)
3
#099089 (PIP2;8)
(明所 → 暗所 での気孔閉鎖の時間経過)
（ΔPIP2;5）
Col
#099862 (PIP2;3)
#117876 (PIP2;3-2)
#072405 (PIP2;5)
#099089 (PIP2;8)
3.5
3
2.5
2.5
2.5
2
2
2
1.5
1.5
1.5
1
1
0
15
30
45
60
（ΔPIP2;8）
Col
#099862
#117876
#072405
#099089
(PIP2;3)
(PIP2;3-2)
(PIP2;5)
(PIP2;8)
1
0
15
30
45
60
ΔPIP2;3とΔPIP2;5： 暗誘導閉口に関係ない
0
15
30
45
60
ΔPIP2;8： 閉鎖が早い（理由解析中）
トマトアクアポリン （名大：白武先生の研究）
RT-PCR
TIP 8種
XIP 2種
NIP 8種
PIP 9種
SIP 2種
若い果実で多く発現するもの
SiPIP2;3, 2;5など
トマトに新規AQP
XIP ２種発見
合計２５種
アクアポリンタンパクの発現（組織/細胞内）
Indirect immunofluorescense (間接蛍光抗体法)
Alexa 647 (red) conjugated antirat IgG goat antibody
Anti-HvPIP1s rat antibody (IgG)
(common among HvPIP1s)
HvPIP1s
Alexa 488 (green) conjugated
anti-rabbit IgG goat antibody
Anti-HvPIP2;1 (or 2;2) rabbit antibody (IgG)
(specific to each molecular species)
HvPIP2s
(明視野)
内皮
(抗PIP1s抗体)
根毛
中心中
皮層
後生木部
表皮
(抗PIP2;2抗体)
(Overlay)
（PCP 52：663）
AtSIPタンパクの細胞内局在
→ ER
（イネPIPの発現部位） 免疫染色 （東北農研）
免疫前血清
Anti-OsPIP2;1
Anti-OsPIP2;5
OsPIP2;1、OsPIP2;5は、根の内皮細胞の内側（向心側）に多く局在する
免疫電顕 （秋田県立大学）
一次抗体：anti-Kar2 (Bip)、anti-SIP1s
二次：anti-(rabbit IgG) linked with Alexa488
免疫染色
（名大・前島先生）
OsPIP1;3(根)
OsPIP1;3(根)
OsPIP1;1(根)
OsPIP1;1、OsPIP1;3とも細胞内で原形質膜近傍とER膜近傍で検出
免疫染色・・・もとは免疫組織化学（化学発色または発光）が多かったが、現在は蛍光抗体が主流
免疫電顕・・・抗体につなげた金粒子を電顕で検出
環境ストレス応答性 （Stress response)
10
OsPIP2;5
8
6
4
2
0
-11
0
2
4
6
8
12
OsPIP2;1
10
OsPIP2;5
8
6
4
2
0
2.0
-11
0
2
4
6
（×106 copies mRNA/μg total RNA）
140
140
PIP2;5 mRNA
Ep (4:00-8:00)
3.5
3.5
3.0
3.0
2.5
2.5
120
120
8
100
100
Ep
80
80
60
60
1.5
1.5
40
40
6
2.0
2.0
1.0
1.0
0.5
0.5
20
20
00
0.0
0.0
8/1011
8/11日
（６～８月）126/12166/16196/19236/23246/24 77/7167/16197/19207/20217/21227/22287/28307/30317/31 28/2 38/3 48/4 58/5 68/6 78/7 88/9 10
OsTIP1:1
1.5
1.0
0.5
0
2.0
OsTIP2;2
1.5
1.0
0.5
0
蒸散要求量 Ep (W m -2 )
OsPIP2;5mRNA
蒸散要求量Ep（W m-2)
(x10 copies　mRNA/ ug Total RNA)
アクアポリン発現量
アクアポリン発現量
4.0
4.0
冠水 → → → 節間成長
↓
↑
ＴＩＰ発現上昇 → 細胞伸長
光に反応するように見えが 実は蒸散要求（湿度）に応答
4.5
4.5
冠水適応に関与するOsTIPsの同定
（浮イネ Deepwater rice) 名大
Relative protein amount
OsPIP2;1
(x 106 copies / 1μg total RNA)
12
mRNA amounts
(x 106 copies / 1μg total RNA)
mRNA amounts
根での発現におよぼす地上部の影響（イネ） 東北農研
Dry (RH=40～50%)
Humid (RH=90%)
非 半 全 非 半 全
冠 冠 冠 冠 冠 冠
水 水 水 水 水 水
1日
３日
タンパク量
温度応答性（Temperature)
低温 Chilling
（秋田県大）
25℃
So: Chilling tolerant rice
Wa: Chilliing senxsitive rice
→ ４℃ → ２５℃（Recovery）
高温 High temperature （名大）
低温ストレス応答 （イネアクアポリン）
シロイヌナズナPIP2;3は高温に応答する
イネＰIP１；３は低温耐性と関連
低温で根の吸水量が減り、しおれる植物の事例
イネ （春季の低水温）
ソラマメ
地上部 5ºC
5ºC
Shoot
地下部 25ºC 5ºC
Root
→ アクアポリンの機能と発現量が低温（冷温）によって低下する
アクアポリンあたりの活性が下がる → どう対応するか？
アクアポリンの数を増やして、細胞あたりの活性を維持する
(耐寒性Figleaf Gourd（クロダネカボチャ）の場合）
Days at low temp.
Days at low temp.
アクアポリン
タンパクの量
(Western blotting)
Chilling tolerant
Chilling sensitive
イネの吸水障害を克服する一つの方法
軽い脱水処理（浸透圧処理） → アクアポリンの発現量上昇
→ 低温条件下での、吸水量低下が軽減 → 耐冷性強化
水輸送活性の制御
リン酸化サイトアミノ酸の置換
Substitution
リン酸化Phosphprylation・・・活性化
0.4
水透過係数 Pf ( 10-2 cm/s)
抗リン酸化抗体によるリン酸化の検出 （名大）
0.3
0.2
0.1
0
果実肥大（吸水）時にリン酸化↑
Fruit riping
根の水透過性Lpｒとリン酸化（オオムギ）
根の水透過性はリン酸化を阻害
すると阻害される
LPr [10-6 ms-1 MPa-1]
Water PcPIP2:2 AlaAla
(SerSer)
AspAla
AlaAsp
AspAsp
アミノ酸置換
0.8
0.6
リン酸化阻害剤
Sutaurosporine
(kinase inhibitor)
0.4
0.2
0
DMSO (%)
St (μM)
0.1
-
0.1
0.1
0.1
1.0
0.1
10.0
Oocyte swelling assay
チューリップ
開花時にもリン酸化↑
Flowering
アサガオ
Kinase inhibitor
抗リン酸化抗体
抗PIP（全体）抗体
•
朝の開花前に活性化
•
•
•
•
低温→高温で開花
花の細胞（特に花下部の細胞）が吸水
原形質型アクアポリン・・・恒常的発現
低温→高温でアクアポリンのリン酸化
（リン酸化されて、水輸送活性上昇）
分子間相互作用 heteromerization
(First reported in Maize, Plant Cell 16:215. 2004)
(ここではオオムギでの研究結果を示す)
HvPIPs Single injection
Relative volume
1.25
HvPIP1;1
HvPIP1;2
HvPIP1;3
HvPIP1;4
HvPIP1;5
HvPIP2;1
HvPIP2;2
HvPIP2;3
HvPIP2;4
HvPIP2;5
Water
1.2
HvPIP2s (2;1~ 2;5)
1.15
1.1
1.05
1
0
活性あり
HvPIP1;2 or other HvPIP1s
and negative control
活性なし
20 40 60 80 100 120 140 160 180
Time (sec)
Co-injection of HvPIP１s and HvPIP２s
（水透過性）
活性化
RNAインジェクション量
Pf：吸水グラフの傾き（吸水速度）から算出する水透過性
HvPIP1s とHvPIP2sの共発現 → 活性化(Hetermelization)
HvPIP1;x
HvPIP2;x
HvPIP2;x
HvPIP1;x
分子種間相互作用の分子機構 ・・・ キメラ分子の作成 → N末が相互作用部位
N末
Water
１型
PIP1;2(10 ng)
２型
PIP2;4(2 ng)
PIP2;4(2 ng) + PIP1;2(10 ng)
PIP1;2(N2;4)(10 ng)
PIP2;4(N1;2)(2 ng)
PIP2;4(N1;2)(2 ng)+PIP1;2(N2;4)(10 ng)
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
Pf ( x 10-2 cm/s)
1.4
1.6
1.8
2
Co-expression of HvPIP1;2 and HvPIP2;4
activated each others by two means:
① Translocation to the plasmamembrane
② Direct activation
┏ 検出用蛍光標識抗体 ┓
Fluorescence antibodies
抗HvPIP2;4抗体
抗HvPIP1s抗体
Single expression
PIP2;4
PIP2;4
PIP2;4
Co-expression
PIP1;2
HvPIP2;4-injection HvPIP1;2-injection
PIP1;2
PIP1;2
PIP1はPIP2と共に膜へ移行して機能する
Inactive HvPIP2;1 T229M can activate PIP2;1 via heteromerization
Inactive HvPIP2;4 T229M can activate PIP1;2 via heteromerization
Inactive HvPIP1;2 T238M can activate PIP2;4 via heteromerization
Water
PIP1;2(10 ng)
PIP1;2T238M(10 ng)
PIP2;4(2 ng)
PIP2;4T229M(2 ng)
PIP2;4T229M(2 ng) + PIP1;2T238M(10 ng)
PIP2;4(2ng)
ng)++PIP1;2T238M
PIP1;2M238(10
ng)
PIP2;4(2
(10 ng)
PIP2;4T229M(2 ng) + PIP1;2(10 ng)
PIP2;4(2 ng) + PIP1;2(10 ng)
0
0.5
1
Pf (x10-2 cm/s)
1.5
PIP2;4T229M ---- Thr 229 is replaced by Met.
< Loss of water transport activity>
PIP1;2T238M ---- Thr 238 is replaced by Met.
< Loss of water transport activity>
2
2.5
活性調節機構 （共発現／分子種間相互作用）
イネプロトプラスト
相互作を蛍光で検出
（秋田県大）
植物組織（オオムギ根:前出）
内皮
皮層
表皮
H2O
道管
<Apoplastic or Symplastic >
Root hair
PIP1とPIP2が共発現
主にPIP1s
主にPIP2s
（HvPIP2;2)
分子間相互作用による活性制御を組織ごとに使
い分けている可能性
水輸送活性の調節 Internalization/Recycling
haruna
K305
I743
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Salt tolerance: low
Salt tolerance: middle
Salt tolerance: high
0
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
Barley Lpr after 100 mM NaCl (Time course)
4
8
12
16
Time [h]
20
24
Rice (Nipponbare) Lpr after 100 mM NaCl
2
1.5
1
No reduction of Lpr
0.5
0
0
4
8
12
Time [h]
16
20
24
Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and
possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress
Lpr of Haruna-nijo after salt
(100 mM NaCl) or osmotic
(177 mM sorbitol) stress
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
NaCl
DMSO
OA
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
Isotonic sorbitol induced
identical Lpr change
100
0
-
100
0.1
-
100
0.1
0.5
(mM)
(mM)
(μM)
0.8
0.7
0.6
0.5
0.4
0.3
0.2
0.1
0
NaCl
DMSO
OA
wm
100
-
100
0.1
3
100
0.2
0.5
3
(mM)
(mM)
(μM)
(μM)
Protein-phosphatase inhibitor (Okadaic acid; OA) and enodcytosis inhibitor (wortmannin:
wm) inhibit salt-induce Lpr reduction at 1 h after stress
Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and
possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
Lpr of Haruna-nijo after salt
(100 mM NaCl) or osmotic
(177 mM sorbitol) stress
0.4
0.3
0.2
Exocytosis inhibitor (brefeldin A : BFA )
inhibits temporal recovery of Lpr at 4 h after
stress
0.1
0
NaCl
DMSO
BFA
100
0.1
-
100
0.1
5
Root hydraulic conductance (Lpr) is regulated by phosphorylation and
possible trafficking of aquaporins in early phase of salt/osmotic stress
Lpr of Haruna-nijo after salt
(100 mM NaCl) or osmotic
(177 mM sorbitol) stress
Lpr [10-6 m s-1 MPa-1]
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Time
DMSO
MG132
1
-
1
0.1
5
2
-
2
0.1
5
4
-
4
0.1
5
8
-
8
0.1
5
12
-
12
0.1
5
Proteasome inhibitor (MG132 ) inhibits reduction of Lpr after stress > 4 h
24
-
24
0.1
5
Barley Lpr after 100 mM NaCl ot isotonic sorbitol/manitol
リン酸化、細胞内局在、タンパク質合成／分解が
水透過性の浸透圧ストレス応答に関与している
処理
水透過性
リン酸化阻害剤
（ストレス処理前）
低下
エンドサイトーシス阻害
（1時間）
低下しない
エキソサイトーシス阻害
（4時間）
回復しない
ストレス解除
（４時間以降）
回復
タンパク質分解阻害
（ストレス下４時間以降）
回復
Salinity (Osmotic) stress
Model
Non-stress
H2O
Osmotic stress
signal
PIP aquaporin
WM
OA
P
Severe stress
P
BFA
（<4h）
Transient
Pool
Mild stress
（>4h）
Activated
mRNA & Protein
degradation
MG132
Protein
degradation
Early Effects of Salinity on
Water Transport in
Arabidopsis Roots. Molecular
and Cellular
Features of Aquaporin
Expression. Boursiac et al.
Plant Physiology (2005)
139:790
Standard sol.
GFP-LTP
100 mM NaCl
45 min
120 min
原形質膜マーカー
タンパク
PIP1;1-GFP
PIP2;1-GFP
Stimulus-induced downregulation of root water transport involves reactive oxygen
species-activated cell signalling and plasma membrane intrinsic protein internalization.
Boursiac et al. The Plant Journal (2008) 56, 207–218
Fluorescence recovery after
photobleaching reveals high
cycling dynamics of plasma
membrane aquaporins in
Arabidopsis roots under salt
stress.
Luu et al. Plant Journal （2012）
69:894
Selective regulation of maize plasma membrane aquaporin trafficking and activity by the
SNARE SYP121. Plant Cell （2012）24: 3463
YFP
CFP or
FM4-64
merge
mYFP:ZmPIP2;5
FM4-64
mYFP:ZmPIP2;5
mCFP:PMA2
(PM marker)
Co-expression
mYFP:ZmPIP2;5
mCFP::AtSYP121-Sp2
（変異AtSYP121)
Co-expression
SNARE: Soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor
Nature Cell Biology 14(10), 991-998 (2012)
Background
• Aquaporin determines Lpr.
• Total root water uptake depends on root
architecture and amount (including root hair).
• Auxin changes root formation.
• How about relationship between PIPs and Auxin?
Nature 446, 621-622 (2007)
Auxin response factor (ARF) proteins function as transcription
factors controlling auxin-responsive genes. ARF7 plays a key role
during lateral root formation and emergence.
arf7: loss-of-function mutant ARF7
Bending induced lateral root
formation
Most PIPs decreased
after bending.
AtPIPsの発現量
PIP amounts
water relations
Auxin
Receptor mutant (arf7)
Bending
Lpr-h: Root hydraulic conductivity
(root pressure chamber)
Lpr-o: Root osmotic conductivity
(natural sap exudation)
Lpcell: Cell hydraulic conductivity
(cell pressure chamber)
T1/2, Turgor, Ep
GUS・・・PIP2;1 transcript accumulation
mCHERRY・・・PIP2;1 protien accumulation
mirror image to Auxin accumulation
IAA reduced PIP2;1 expression
and induce lateral root
formation
Auxin inhibitor increased PIP2;1
expression and reduced lateral
root formation
形質転換体
水輸送との関係
Transgenic rice
* Expression analysis
<qRT-PCR>
(WT: Nipponbare 24-day old)
Absolute
quantification
• Mutant lines of OsPIP2;4
Root specific
Internal standarads: eEF-1α：Eukaryotic elongation factor 1-alpha
UBC： Ubiquitin-conjugating enzyme E2
Overexpression
Antisense
T-DNA (POSTECH, Korea)
Acknowledgement:
The vector for the transgenic rice plants were kindly provided by Dr.
Ichikawa (NIAS) and Dr. Horiguchi (NIBB).
Total OsPIP mRNAs in roots and Lpr in OsPIP2;4 overexpressor
VS. WT
Lpr
14
*
12
OsPIP2;4
Lpr (10-6 m s-1 MPa-1)
10
8
WT
OsPIP2;4OE
6
4
*
2
0
WT
NOTE: Less increases of total OsPIP mRNAs.
OsPIP2;4OE
P＜0.05
Expressions of OsPIPs in roots of OsPIP2;4 transgenic lines
○
PIP1;1
PIP1;2
PIP1;3
PIP2;1
PIP2;2
◎
◎
◎
○
PIP2;3
PIP2;4
PIP2;5
PIP2;6
Root specificity
PIP2;7
PIP2;8 eEF-1α
UBC
x6.4
P＜0.05
P＜0.001
Total mRNAs in the T-DNA line (root)
96%
PIP2;4 OE
Wt
PIP2;4 T-DNA
Other PIPs
Other PIPs
Compensative change against OsPIP2;4
mRNA.
OsPIP2;4
↓
○
↓
↑
↓
↑
↑
Root specificity
Changes in roots
Wild-type（WT）
Osmotic stress
／WT Non-stress
PIP2;4 T-DNA line
Non-stress
／WT Non-stress
PIP2;4
Overexpression
line（OE）
Non-stress
↓ ↓
↑
／WT Non-stress
Osmotic stress
／PIP2;4 OE Non-stress
↓
↑ ↓
◎◎◎○
↓ ↓ ↓
↑ ↓ ↑ ↑
↓ ↑ ↓ ↓
↓
Up-regulation （P＜0.05）
Down-regulation（P＜0.05）
• Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4.
Simultaneous down-regulation under osmotic stress.
Compensative regulation against OsPIP2;4 in transgenic lines.
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↓
↑ ↑
↑
↓
○
↓
↑
↓
↑
↑
Root spesificity
Changes in roots
Wild-type（WT）
Osmotic stress
／WT Non-stress
PIP2;4 T-DNA line
Non-stress
／WT Non-stress
PIP2;4
Overexpression
line（OE）
Non-stress
↓ ↓
↑
／WT Non-stress
Osmotic stress
／PIP2;4 OE Non-stress
↓
↑ ↓
◎◎◎○
↓ ↓ ↓
↑ ↓ ↑ ↑
↓ ↑ ↓ ↓
↓
Up-regulation （P＜0.05）
Down-regulation（P＜0.05）
• Expression of root specific OsPIPs were co-regulated with OsPIP2;4.
OsPIP1;3 may compensate OsPIP2;4 activity partially.
Co-expression increased the activity in oocyte system.
(Modified after Matsumoto et al. PCP 50:216 (2009))
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